Раздавленная капля - препарат в микробиологии. Раздавленная капля Метод висячей и раздавленной капли

Приготовление прижизненных (нативных) препаратов.

Культуры для приготовления препарата.

Материалы для исследования и техника взятия

Вопросы для рассмотрения

1. Руководство к практическим занятиям по микробиологии. Под редакцией Егорова Н.С. МГУ, М. 1995г. Стр. 81-97, 20-28.

2. Коротяев А.И., Бабичев С. А. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология. «Спец. литература». Санкт-Петербург, 1998. Стр. 14-18.

3. Теппер Е.З., Шильникова В.К., Переверзева Г.И. Практикум по микробиологии. «Колос», М. 1972. Стр. 5-23.

ТЕМА: Приготовление микроскопических препаратов и их окраска.

1. Приготовление прижизненных (нативных) препаратов.

2. Приготовление мазков и их фиксация.

3. Красители, используемые в микробиологии.

4. Простые и сложные методы окраски.

Задание для выполнения лабораторной работы

1. Приготовить фиксированный препарат из молодой культуры дрожжей, окрасить его в течение 2-3 мин метиленовым синим и микроскопировать без иммерсии.

2. Приготовить фиксированный препарат из почвенной суспензии, окрасить по методу Грама, микроскопировать его и зарисовать.

3. Выполнить схематическое изображение клеточной стенки грамотрицательных и грамположительных прокариот.

Для приготовления препарата исследуемый материал берут из пробирки, колбы или чашки Петри бактериологической петлей, обоженной в пламени спиртовки или стерильной пипеткой.

Пробирку с бактериальной культурой берут в левую руку, а петлю за петледержатель в правую. Правой рукой вращательным движением вынимают из пробирки ватную пробку, зажимая ее между мизинцем и ладонью, а края пробирки обжигают в пламени спиртовки. Осторожно вводят петлю в пробирку, охлаждая ее о внутреннюю поверхность стекла, после чего легким скользящим движением берут материал. Затем вынимают петлю из пробирки, снова обжигают ее край и ватную пробирку и закрывают пробирку. После приготовления препарата петлю обязательно прожигают (стерилизуют) в пламени спиртовки.

Для исследования живых клеток микроорганизмов применяют методы «раздавленной и висячей капли». В обоих случаях возможно окрашивание объекта “прижизненными” красителями – “витальная” окраска.

На чистое предметное стекло наносят каплю воды. В каплю вносят культуру и смешивают с водой. Накрывают каплю покровным стеклом так, чтобы не образовались пузырьки воздуха. Стеклянной палочкой прижимают покровное стекло к предметному. Капля должна быть небольшой, не выходящей за края покровного стекла, но если суспензия попала за край - удаляют фильтровальной бумагой. Микроскопируют препарат с объективом 40Х. Метод удобен для исследования подвижности бактериальных клеток, а также просмотра крупных объектов - плесневых грибов, дрожжей. Применяют при изучении запасных веществ клетки. Метод “висячей” капли – используются для длительных наблюдений за клетками микроорганизмов. Препарат готовят на покровном стекле, в центр которого наносят одну каплю бактериальной культуры. Затем предметное стекло с лункой, края которой предварительно смазывают вазелином, прижимают к покровному стеклу так, чтобы капля находилась в центре лунки. Быстрым движением переворачивают препарат покровным стеклом вверх. В правильно приготовленном препарате капля должна свободно висеть над лункой, не касаясь её дна или края. Для микроскопии вначале используют малый сухой объектив 8Х, под увеличением которого находят край капли, а затем устанавливают иммерсионный объектив.

Прижизненная (витальная) окраска. Взвесь микроорганизмов вносят в каплю раствора метиленового синего или нейтрального красного в концентрациях от 0,001 до 0,00001%. Затем готовят препарат по одному из выше указанных методов и микроскопируют. После микроскопии препараты, «раздавленной» или «висячей» капли опускают в дезинфицирующий раствор.

РАЗДАВЛЕННАЯ КАПЛЯ метод при готовления препаратов для микроскопии живых объектов (бактерий, клеток культур тканей и др.). На предметное стекло наносят каплю воды, физиол. р-ра или культуральной жидкости, вносят в неё небольшое кол-во исследуемой культуры, накрывают покровным стеклом, избегая образования пузырьков воздуха. Для наибольшего контраста применяют темнопольную или фазово-контрастную микроскопию. Под микроскопом видны неокрашенные организмы, обведённые светлой или тёмной полоской. Р. к. применяют также для прижизненной окраски (краситель 0,1%-ный р-р нейтрального красного).

Ветеринарный энциклопедический словарь. - М.: "Советская Энциклопедия" . Главный редактор В.П. Шишков . 1981 .

Смотреть что такое "РАЗДАВЛЕННАЯ КАПЛЯ" в других словарях:

раздавленная капля - препарат для витальной микроскопии микроорганизмов, приготовляемый путем помещения капли их взвеси между предметным и покровным стеклами … Большой медицинский словарь

Микробиологи́ческая диагно́стика - основана на идентификации возбудителя или выявлении иммунного ответа организма больного на него. Начальным этапом М.д. является отбор материала и транспортировка проб в лабораторию. Вид материала для исследования определяется особенностями… … Медицинская энциклопедия

Микроскопия, исследования невидимых невооружённым глазом объектов при помощи микроскопа. Различают световую М., основанную на использовании световых лучей, и электронную М., где вместо световых лучей применяют поток электронов (см. Электронный… … Ветеринарный энциклопедический словарь

Список основных персонажей серии романов о Гарри Поттере - Серия романов о Гарри Поттере была написана английской писательницей Дж. К. Роулинг с 1997 по 2007 год. В данном списке перечислены все основные персонажи серии романов (в заметной степени повлиявшие на сюжет произведений), а также персонажи,… … Википедия

Методика приготовления препарата:

· на середину предметного стекла наносят каплю бульонной культуры вульгарного протея. Каплю осторожно покрывают покровным стеклом, не допуская образования между стеклами пузырьков воздуха;

· препарат микроскопируют сухой системой, с использованием объектива х40. Оптика микроскопа должна быть очень чисто протерта, конденсор слегка опущен, а его диафрагма прикрыта с целью затемнения поля зрения.

· протей является перитрихом, передвигается в поле зрения беспорядочно. Важно не спутать характер его движения с пассивным перемещением в результате броуновского движения - беспорядочного колебания клеток.

4. Изучение подвижности протея (Proteus vulgaris) в препарате «висячая капля» с использованием фазово-контрастной микроскопии (демонстрация). Препарат висячей капли готовят, нанося в центр покровного стекла каплю исследуемого материала. Предметное стекло с лункой, края которой смазывают вазелином, прижимают к покровному стеклу так, чтобы капля находилась в центре лунки. После этого препарат переворачивают покровным стеклом вверх; капля должна свободно висеть над лункой, не касаясь ее дна или края. При микроскопии сначала используют объектив «малого» увеличения (х8) для нахождения края капли, после чего определяют подвижность бактерий с помощью объектива «большого» увеличения (х40) или иммерсионной микроскопии.

5. Морфология боррелий – возбудителей возвратного тифа (Borrelia recurrentis). Мазок из крови больного возвратным тифом (демонстрация). Окраска по Романовскому - Гимза. Краситель состоит из смеси азура-2 (продукт окисления метиленового синего) и эозина. Среди эритроцитов заметны тонкие лиловые удлиненные спирохеты, образующие до 9 крупных неравномерных завитков.

6. Морфология возбудителя сифилиса (Treponema pallidum). Окраска по Бурри (тушевой препарат). На темном фоне видны бесцветные трепонемы с 8 - 12 равномерными завитками.

7. Морфология и подвижность лептоспир - Leptospira interrogans. Темнопольная микроскопия (демонстрация). Представители этого рода имеют тонкие частые неглубокие завитки и обладают своеобразным движением, во время которого концы вращаются под углом к основной части тела. В стадии покоя имеют форму крючка. В темнопольном микроскопе используются специальные конденсоры (параболоид-конденсор с затемнением в центре и внутренней зеркальной поверхностью для отражения лучей света, либо кардиоид-конденсор, в котором лучи света отражаются сначала от выпуклой поверхности, а затем от вогнутой). Темнопольные конденсоры создают эффект бокового освещения, в результате чего на темном фоне видны светящиеся микроорганизмы. Морфология спирохет представлена на рис. 20.

8. Морфология риккетсий – возбудителей эпидемического сыпного тифа (Rickettsia provazeki).Окраска по Здродовскому. Методика окраски:

· Окраска мазка фуксином Циля в течение 5 минут.

· Промывание водой.

· Обработка мазка 0,01% раствором хлористоводородной кислоты.

· Промывание водой.

· Окраска метиленовым синим в течение 1 минуты.

· Промывание водой, высушивание, микроскопия. Риккетсии, окрашенные по этому методу, выглядят в виде мелких полиморфных микроорганизмов рубиново-красного цвета.

9. Хламидии (Chlamidia trachomatis) в мазках из уретры больных урогенитальным хламидиозом (внутри - и внеклеточное расположение). Демонстрационный препарат, окраска по Романовскому-Гимза.

10. Актиномицеты в материале от больного актиномикозом (окраска по Романовскому-Гимза). Зарисовать типичные для этого заболевания друзы актиномицетов, отметить лучистую структуру актиномицетов.

Тема 4. ФИЗИОЛОГИЯ МИКРОБОВ. АСЕПТИКА, АНТИСЕПТИКА, ДЕЗИНФЕКЦИЯ, СТЕРИЛИЗАЦИЯ. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ БАКТЕРИЙ. БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД ИССЛЕДОВАНИЯ. МЕТОДЫ И ЭТАПЫ ВЫДЕЛЕНИЯ ЧИСТЫХ КУЛЬТУР АЭРОБНЫХ И АНАЭРОБНЫХ БАКТЕРИЙ

1. На середину обезжиренного предметного стекла нанесите петлей 1-2 капли бульонной культуры.

2. Осторожно покройте каплю чистым покровным стеклом.

3. Микроскопируйте с приспущенным конденсором. Используйте объективы с увеличением 40 х.

4. Можно также использовать иммерсионный объектив 100х, нанося на покровное стекло одну каплю иммерсионного масла.

При исследовании живых бактерий следует отличать активную подвижность у отдельных микроорганизмов, свидетельствующую о наличии у них жгутиков, от пассивного броуновского движения (движение бактерий в одном направлении).

Занятие № 7

ЭКОЛОГИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

Изучение микрофлоры ротовой полости

Практические навыки, осваиваемые студентами на занятии:

1. Приготовление мазка из зубного налета, окраска простым методом, микроскопия и зарисовка препарата.

Приготовление мазка из зубного налета

1. На обезжиренное предметное стекло нанесите петлей каплю физиологического раствора.

2. В правую руку возьмите деревянную палочку (зубочистку) и проведите ею между зубами и у основания зубов, снимая небольшое количество зубного налета.

3. Погрузите палочку в каплю физраствора, равномерно распределите зубной налет по стеклу и приготовьте мазок в виде небольшого круга (d»2см).

4. Прожгите в пламени спиртовки конец палочки, потушите и выбросьте ее в урну.

5. После полного высушивания зафиксируйтемазок.

Окраска мазка простым методом с использованием метиленового синего:

1. После охлаждения предметного стекла нанесите 1-2 капли водного раствора метиленового синего на фиксированный мазок (чтобы он был полностью покрыт краской).

2. Окрашивайте в течение 2-3 минут.

3. Смойте краску водой.

4. Просушите препарат фильтровальной бумагой.

Занятие № 8

ОСНОВЫ УЧЕНИЯ ОБ ИНФЕКЦИИ

Биологический метод исследования

1. Приготовление мазков-отпечатков из органов трупа инфицированной мыши, окраска по Граму, микроскопия и зарисовка препаратов.

Для приготовления мазков-отпечатков вырезают из печени, селезенки, почек небольшие кусочки ткани, берут их пинцетом и прикасаются к предметному стеклу, прижимая кусочек ткани к поверхностью разреза.

Мазки-отпечатки фиксируют и окрашивают метиленовым синим или по Граму.

При микроскопии отмеча­ют присутствие микроба-возбудителя в различных органах и тканях.

Занятие № 9

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ХИМИОТЕРАПИИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ИНФЕКЦИЙ

Методы изучения чувствительности бактерий к антибиотикам

1. Определение чувствительности бактерий к антибиотикам методом дисков.

2. Определение бактериостатического и бактерицидного действия антибиотиков.

Качественный метод определения чувствительности бак­терий к антибиотикам (метод дисков).

Бумажные диски, про­питанные определенными антибиотиками, помещают на по­верхность мясо-пептонного агара в чашках Петри, предвари­тельно засеянных «газоном» исследуемой бактериальной культуры.

Посевы инкубируют в течение 16-24 ч, после чего учитывают результаты опыта по образованию светлых зон задержки роста бактерий вокруг дисков. По диаметру этих зон ориентиро­вочно судят о чувствительности бактерий к антибиотикам.

Так, зоны диаметром до 15 мм указывают на слабую, а с диаметром до 25 мм - на среднюю и более 25 мм - на сравнительно высо­кую чувствительность исследуемого микроорганизма к анти­биотику.

Количественный метод определения чувствительности бак­терий к антибиотикам (определение бактериостатического и бактерицидного действия антибиотиков).

Данный метод считается наиболее точ­ным для количественного определения чувствительности бак­терий к антибиотикам.

Основной раствор антибиотика, содер­жащий, например, 100 ЕД/мл, готовят с помощью бу­ферного раствора или специального растворителя.

Серийные разведения препарата (двукратные – 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 )готовят в пробирках, содержащих 1 мл мясо-пептонного бульона: в 1-ю пробирку вносят 1 мл исход­ного раствора препарата, перемешивают и переносят в следующую, в которой уже содержится 1 мл МПБ, и т.д. – таким методом делают серию (ряд) последовательных разведений препарата от 50 до 0,39 ЕД/мл в равных объемах питательной среды.

В каждую про­бирку вносят 0,1 мл испытуемой бактериальной суспензии, густотой 1 млрд/мл по оптическому стандарту. Одновременно ставят контроли - бактерий (1 мл мясо-пептонного бульона+ +0,1 мл суспензии бактерий) и антибиотика (мясо-пептонный бульон + антибиотик).

Посевы инкубируют, после чего отмечают результаты. Отсутствие по­мутнения среды свидетельствует о задержке роста бактерий в присутствии данной концентрации препарата.

Бактериостатической дозой или минимальной ингибирующей концентрацией (МИК) называется наименьшая концентрация антибиотика, в присутствии которой угнетает­ся видимый рост бактерий.

Для определения бактерицидного действия препарата до­полнительно производят высевы из пробирок, в которых от­сутствует видимый рост бактерий, на чашки Петри с плотной питательной средой, не содержащей антибиотика.

Наимень­шая концентрация антибиотика, вызывающая полную гибель испытуемых бактерий, о чем свидетельствует отсутствие роста на агаре без антибиотинка, называется минимальной бактерицидной концентрацией (МБК) .

Иммунология

Занятие № 11

ИММУНОЛОГИЯ КАК НАУКА. ЕСТЕСТВЕННЫЙ ИММУНИТЕТ

Приготовление фиксированного препарата и окраска его по Граму

А. Приготовление фиксированного препарата.

Препараты бактерий готовят на предметных стеклах, которые должны иметь толщину, не превышающую 1,2-1,4 мм. Поверхность стекла должна быть тщательно очищена и обезжирена. В повседневной работе достаточно натереть сухое чистое стекло сухим хозяйственным мылом, после чего тщательно протереть сухой хлопчатобумажной салфеткой; на хорошо обезжиренном стекле капля воды равномерно расплывется (не сохраняет каплевидную форму).

На обезжиренное предметное стекло наносят небольшую каплю водопроводной воды и переносят в неё профламбированной (стерильной) биологической петлей незначительное количество исследуемого материала. Биомассу бактерий вращательным движением петли растирают в капле воды на площади примерно 4 см 2 . Слой должен быть настолько тонким, что мазок высыхает почти сразу после приготовления.

Высушивание мазка следует проводить при комнатной температуре на воздухе. Если оно замедлено, то препарат можно слегка нагреть в токе теплого воздуха высоко над пламенем горелки, держа стекло мазком вверх. Эту операцию следует проводить крайне осторожно, не перегревая препарат, иначе клетки микроорганизмов деформируются.

Фиксация мазка преследует несколько целей: убить микроорганизмы, приклеить их к стеклу, обеспечить лучшее окрашивание. Для того, чтобы зафиксировать мазок, нужно три раза провести предметное стекло через самую горячую часть пламени горелки, держа его мазком вверх.

Б. Окраска препарата по Граму .

На зафиксированный мазок помещают фильтровальную бумажку и наносят краситель генцианвиолет на 1,5-2 мин. (на этой стадии операции необходимо следить, чтобы краситель проходил на мазок через фильтр). Далее фильтровальную бумагу убирают и наносят на мазок раствор Люголя также на 1,5-2 мин. Раствор Люголя сливают и обрабатывают мазок 96%-м этиловым спиртом в течение 30 сек. Затем мазок промывают водой, докрашивают фуксином Циля (1,5-2 мин.) и промывают водой до «светлой капли». Далее мазок высушивают, наносят на него иммерсионное масло и изучают в микроскопе при увеличении объектива 90 х.

Методы исследования живых клеток

А. Препарат «раздавленная капля»

На обезжиренное предметное стекло наносят каплю водопроводной воды и помещают в неё небольшое количество культуры изучаемых микроорганизмов. Взвесь бактерий размешивают и прикрывают покровным стеклом. Капля исследуемого материала должна быть настолько мала, чтобы после прижимания её покровным стеклом не было избытка жидкости, выступающего из-под него. В противном случае избыток жидкости необходимо удалить фильтровальной бумагой, которую затем следует сразу опустить в дезинфицирующий раствор.

Б. Препарат «висячая капля» .

Каплю суспензии микроорганизмов биологической петлей наносят на покровное стекло, которое затем переворачивают каплей вниз и помещают над лункой специального предметного стекла (стекло с лункой). Капля должна свободно висеть, не касаясь краев и дна лунки. Края лунки предварительно смазывают вазелином для герметизации камеры.

В. Препарат «отпечаток»

Из агаризованной среды, на которой микроорганизмы растут сплошным газоном или в виде отдельных колоний, вырезают скальпелем небольшой кубик и переносят его на предметное стекло таким образом, чтобы поверхность с микроорганизмами была обращена вверх. Затем к газону или к колонии прикладывают чистое покровное стекло, слегка надавливают на него петлей или пинцетом и тотчас же снимают, стараясь не сдвинуть в сторону. Полученный препарат (покровное стекло) помещают отпечатком вниз в каплю воды или метиленового синего на предметное стекло. Отпечаток можно получить и на предметном стекле, если касаться поверхности колонии предметным стеклом.

Препараты живых клеток рассматривают с «сухими системами» микроскопа. После микроскопирования такие препараты перед мытьем должны быть выдержаны в дезрастворе.

Цитохимические методы исследования строения микробов

А. Окраска капсул и приготовление красителей

а) Окраска капсул

Для окраски капсул применяют методы Михина, Ольта, Ребигера, Романовского-Гимза, Гинса, негативный метод Бурри.

Метод Михина. Фиксированный мазок окрашивают синькой Леффлёра в течение 2-3 мин. при подогревании (до появления паров), после чего краску быстро смывают водой и мазок высушивают между листами фильтровальной бумаги. Клетка окрашивается в темно-синий цвет, капсула - в светло-розовый.

Метод Ольта. Фиксированный препарат окрашивают 2-3%-м водным раствором сафраина в течение 1-3 минут (лучше при подогревании) и быстро промывают водой. Раствор сафраина готовят перед употреблением, растворяя краску в воде, доведенной до кипения, затем фильтруют через бумажный фильтр. Клетки окрашиваются в красно-коричневый цвет, капсулы - в бледно-желтый.

Метод Ребигера. Окрашивают и фиксируют препарат одновременно формалиновым раствором генцианвиолета. Нефиксированные мазки окрашивают 15-20 сек., быстро промывают водой и высушивают фильтровальной бумагой. Клетки окрашиваются в темно-фиолетовый цвет, капсулы - в красновато-фиолетовый.

Метод Романовского-Гимза. Краску фабричного приготовления перед окрашиванием мазков растворяют из расчета одна капля краски на 1 мл дистиллированной воды. Разведенную краску наливают на дно чашки Петри, в которую кладут две тонкие стеклянные палочки или спички. Мазок, зафиксированный метиленовым спиртом, помещают в чашку до соприкосновения с краской (бактерии находятся на нижней плоскости мазка). Окрашивание проводят 30-40 минут. Препарат промывают водой и высушивают на воздухе в вертикальном положении. Клетки окрашиваются в сине-фиолетовый, а капсулы - в красно-фиолетовый цвета.

Негативный метод Бурри. На обезжиренное предметное стекло наносят каплю туши, разведенную в 10 раз дистиллированной водой. В тушь вносят каплю исследуемой культуры и хорошо смешивают. Полученную взвесь другим стеклом равномерно распределяют по поверхности предметного стекла, высушивают на воздухе. Препарат рассматривают с иммерсией. На темно-дымчатом фоне хорошо видны неокрашенные капсулы и клетки бактерии.

Метод Гинса. На край предметного стекла наносят каплю туши, вносят в неё клетки, хорошо перемешивают и ребром другого стекла делают мазок по всей поверхности стекла. Мазок высушивают на воздухе и фиксируют 5-10 минут жидкостью Никифорова или 3 минуты абсолютным метанолом. Далее мазок окрашивается фуксином Циля, разбавленным водой в соотношении 1:3. Время окрашивания 2-3 мин. Препарат промывают водой, высушивают на воздухе и микроскопируют с иммерсией. На темно-сером фоне выделяются розово-малиновые клетки, окруженные бесцветными капсулами.

Окраска капсул бактерий по Муромцеву. На фиксированный мазок наносят краситель Муромцева на 30-40 сек., мазок промывают, высушивают, микроскопируют с иммерсией. Микроскопическая картина - капсулы розовые, бактерии - темно-синие.

б) Приготовление красителей для окраски капсул.

Синька Леффлера. Насыщенный спиртовой раствор метиленовой сини: 1,6 г метиленового синего растворяют в 100 мл 95%-го этилового спирта.

30 мл насыщенного спиртового раствора метиленового синего смешивают со 100 мл 0,01%-го раствора КОН.

Раствор КОН : 0,01 г КОН развести в 99,99 мл дист. воды.

Раствор сафраина. 3 г сафраина смешать с 97 мл дистиллированной воды, довести до кипения, профильтровать. Краска готовится перед употреблением.

Формалиновый раствор генцианвиолета. 15-20 г генцианвиолета растворить в 100 мл 40%-го формалина, оставить на 6-8 часов при комнатной температуре, профильтровать, после чего он готов к употреблению.

Краситель Романовского-Гимза. Готовый реактив разводят перед употреблением: 1 капля краски на 1 мл дистиллированной воды.

Смесь Никифорова. Этиловый спирт и серный эфир в равных объемах.

Комбинированная краска по Муромцеву. Первый раствор - фуксин основной - 0,15 г, спирт этиловый 96%-й - 20 мл, карболовая кислота кристаллическая (фенол) - 10 г. Второй раствор - метиленовый голубой - 2,5 г, вода дистиллированная - 200 мл. Оба раствора смешивают и фильтруют через бумажный фильтр.

Б. Определение кислотоустойчивости бактерий.

Кислотоустойчивость - свойство, характерное для некоторых микобактерий и нокардий. Оно заключается в сохранении окраски клетками этих бактерий при обработке их кислотой. Кислотоустойчивость связана с особенностью химического состава клеточной стенки этих бактерий: в ней содержится много сложных липидов и миколовых кислот.

На обезжиренном предметном стекле готовят два мазка: исследуемых клеток и клеток кислотоустойчивых микобактерий. Препарат высушивают на воздухе и фиксируют в пламени горелки. На препарат помещают фильтровальную бумагу и заливают карболовым фуксином Циля и затем 2-3 раза подогревают его до появления паров, держа стекло высоко над пламенем горелки. За появлением паров наблюдают, глядя на мазок сбоку; при их появлении тотчас отставляют препарат в сторону. После этого препарату дают остыть, снимают фильтровальную бумагу, сливают краситель и мазок промывают водой. Затем препарат обесцвечивают 5%-ой серной кислотой. Для этого предметное стекло 2-3 раза погружают в стакан с кислотой, не задерживая его в ней. Препарат вновь тщательно промывают водой и докрашивают 3-5 минут синькой Леффлера. Краску сливают, препарат промывают водой, высушивают и исследуют с иммерсией. Кислотоустойчивые клетки приобретают красный цвет, тогда как некислотоустойчивые - синий. Кислотоустойчивость можно определять у клеток любого возраста.

Реактивы для определения кислотоустойчивости.

Фуксин Циля. 5 %-й раствор свежеперегнанного фенола 100%, насыщенный спиртовой раствор фуксина основного - 10 мл. Приготовленную смесь отфильтровывают через 48 часов. Краситель устойчив при хранении.

Другой способ получения фуксина Циля: фуксин основной - 1 г, фенол кристаллический - 5 г, спирт 96 %-й - 10 мл, глицерин - несколько капель, вода дистиллированная - 100 мл. Основной фуксин растворяют в этаноле, затем добавляют растворенный в воде фенол. Раствор перемешивают и оставляют на несколько дней. Перед использованием его фильтруют.

В. Окраска спор и приготовление реактивов.

а) Окраска спор

Споры по сравнению с цитоплазмой характеризуются более высоким показателем преломления света, поэтому при микроскопировании в светлом поле они видны как более темные включения округлой или овальной формы. При использовании фазово-контрастного устройства споры имеют вид светлых включений на фоне почти черных клеток.

Эндоспоры обладают многослойными труднопроницаемыми оболочками, поэтому при простой обработке препарата спорообразующих бактерий фуксином или генцианвиолетом споры не окрашиваются. При микроскопировании они обнаруживаются в клетке в виде бесцветных включений. Свободные споры имеют вид колец.

Метод Пешкова. Мазок готовят на обезжиренном предметном стекле, высушивают на воздухе, фиксируют в пламени горелки и заливают раствором метиленовой сини по Леффлёру. Краситель доводят до кипения, держа стекло над пламенем горелки. По мере испарения красителя добавляют новые его порции. Продолжительность окраски, считая с момента закипания, - 10-20 сек. Затем предметное стекло охлаждают, тщательно промывают водой и докрашивают в течение 30 сек. 0,5%-м водным раствором нейтрального красного или сафраина. Краситель сливают, мазок промывают водой и просматривают с иммерсионной системой. При правильном окрашивании клетки имеют красный, а споры - синий цвет. Вместо метиленового синего можно использовать другой краситель - малахитовый зеленый. В этом случае фиксированный препарат заливают на 7-10 минут 7,5%-м раствором малахитового зеленого. Окрашивание проводят с подогревом, помещая препарат над сосудом с кипящей водой или над пламенем горелки. По окончании окраски предметное стекло охлаждают и докрашивают 0,25%-м водным раствором сафраина в течение 1-2 минут. Споры окрашиваются в зеленый цвет, клетки - в розовый.

Метод Циля - Нильсена в модификации Мюллера. На фиксированный над пламенем мазок наливают 5%-й водный раствор хромовой кислоты, которую через 5-10 минут смывают водой. Препарат накрывают полоской фильтровальной бумаги и обильно смачивают карболовым фуксином Циля. Подогревают препарат над пламенем до появления паров, но не до кипения, потом отводят его в сторону и добавляют новую порцию красителя (так в течение 7 минут). При этом важно, чтобы краситель испарялся, но бумага не подсыхала. После охлаждения мазка её снимают, препарат промывают водой и тщательно промокают фильтровальной бумагой. В результате такой обработки клетки со спорами равномерно прокрашиваются. Поэтому для обесцвечивания цитоплазмы препарат затем обрабатывают 1%-м раствором соляной или серной кислоты в течение 15-30 секунд. При превышении этого времени может обесцветиться и спора. Затем препарат промывают водой и докрашивают метиленовым синим 2 мин. Если все операции проделаны правильно, окраска получиться контрастной и споры ярко-красного цвета будут четко выделяться на голубом фоне цитоплазмы.

б) Реактивы для окрашивания спор бактерий

1. Карболовый фуксин Циля (см. выше).

2. Метиленовый синий Леффлёра (см. выше).

3. Насыщенный водный раствор метиленового синего: 2 г красителя растворить в 100 мл дистиллированной воды.

4. Хромовая кислота, 5%-й раствор.

5. Кислота соляная или серная, 1%-й раствор.

6. Сафраин, водный раствор: 2,5%-й раствор сафраина в 96%-м этаноле - 10 мл, вода дистиллированная - 100 мл.

7. Малахитовый зеленый: малахитгрюн - 7,5 г, вода дистиллированная - 92,5 мл.

8. Метиленовый синий насыщенный спиртовой раствор: метиленовый синий - 3 г, 96%-й спирт - 100 мл. Раствор оставляют на 2-3 дня, несколько раз перемешивают, потом фильтруют. Раствор устойчив.

9. Метиленовый синий по Леффлёру (другой рецепт): 30 мл насыщенного спиртового раствора метиленового синего растворить в 100 мл дистиллированной воды, добавить 1 мл 1%-го водного раствора КОН.

Г. Окраска жгутиков

а) Приготовление препарата

Отдельный бактериальный жгутик настолько тонок, что неразличим в световом микроскопе, если он не окрашен особым способом, который увеличивает толщину жгутиков. Существует несколько способов окраски жгутиков. Все они основаны на использовании различных протрав, осаждающихся на поверхности жгутиков, благодаря чему диаметр жгутиков увеличивается в диаметре и они становятся видимыми в световом микроскопе. Окраска жгутиков требует тщательной подготовки культуры и аккуратности в работе, так как жгутики легко обламываются даже при легком взбалтывании культуры.

Для подготовки культуры рекомендуется ежедневно несколько дней подряд делать пересевы культуры на свежую питательную среду в жидкую среду или в конденсационную воду свежей скошенной агаризованной среды. Кроме того, в день просмотра можно брать петлей материал и переносить в пробирку с 5-6 мл стерильной водопроводной воды, нагретой до 37°С. Не рекомендуется болтать петлей в воде, бактериальная масса сама должна в течение 30-60 мин разойтись в ней.

Прежде чем приступить к работе, необходимо проверить подвижность клеток в висячей капле. В случае отсутствия подвижности пробирку оставляют в термостате на 1,5-2 суток.

Для приготовления препаратов необходимы совершенно чистые предметные стекла. Их кипятят в растворе бихромата калия в крепкой серной кислоте, затем дважды промывают в растворе едкого натра. После этого стекла промывают водой и хранят в банке с 96%-м спиртом. Пред приготовлением мазка следует сильно нагреть ту сторону стекла, на которую будет нанесен мазок, но наносить его надо на охлажденное стекло.

б) Методы окрашивания.

Метод Леффлёра. Суспензию бактерий наносят на стекло пастеровской пипеткой или петлей (3-4 маленьких капли) и сушат при комнатной температуре. Допускается фиксация мазка быстрым одноразовым проведением через пламя. Далее препарат заливают протравой на 3-5 минут при нагревании до появления паров или 15-20 минут при комнатной температуре, потом промывают сильной струей дистиллированной воды 30 сек. и высушивают на воздухе. Окрашивают препарат карболовым фуксином Циля 3-4 минуты при легком нагревании до появления пара (фуксин содержит 1 часть насыщенного спиртового раствора фуксина и 10 частей воды, или в соотношении 1:1). Затем препарат промывают водой и исследуют с иммерсией. Жгутики и клетки бактерий окрашиваются в розовый цвет.

Метод Фонтана. В пробирку с 0,5 мл стерильной водопроводной воды вносят клетки, взятые на границе с конденсационной водой. Материал берут осторожно, слегка касаясь культуры, а не вести биологической петлей по поверхности агара. Петлю с бактериальной массой оставляют в воде на 1 час. За это время подвижные бактерии окажутся свободно взвешенными в воде. Затем петлю вынимают, прокаливают, охлаждают и только после этого ею берут капли взвеси бактерий и осторожно наносят на обезжиренное предметное стекло. Нанесенные капли не размазывают, они должны быстро высохнуть, лучше в термостате. Мазки фиксируют 5 минут жидкостью Руге. Препарат промывают водой, заливают протравой (см. ниже) и подогревают стекло до появления паров в течение 2 минут. Протраву сливают, препарат тщательно промывают водой. Далее обработку препарата проводят серебрением: разбавленный аммиачный раствор серебра наливают на мазок и стекло несколько раз осторожно подогревают в течение 2-х минут до появления паров. Препарат промывают водой, высушивают и микроскопируют с иммерсией. Бактерии в препарате окрашены в черный или темно-коричневый цвет, а жгутики (часто спутанные) - в светло-коричневый или желтый.

Метод серебрения жгутиков по Морозову. Препарат готовится, как описано выше. На препарат наливают на 1 минуту реактив №1. Затем его сливают, промывают водой и наливают реактив №2. Подогревают на слабом пламени до появления паров, тщательно промывают водой и 1-2 минуты (при подогревании) обрабатывают препарат реактивом №3 до появления темно-коричневой окраски мазка. Мазок тщательно промывают водой, высушивают и микроскопируют с иммерсией.

в) Реактивы для окраски жгутиков.

Приготовление протравы : 12 г танина растворяют при нагревании в 48 мл воды, добавляют 30 мл насыщенного раствора железного купороса FeSO 4 и 6 мл насыщенного раствора фуксина в 96%-м спирте. Смесь готовят за несколько дней до употребления, хранят в склянке с притертой пробкой в темном месте. Перед употреблением фильтруют.

Краситель : карболовый фуксин Циля и дистиллированная вода в соотношении 1:1. Готовят перед употреблением и фильтруют.

Реактив №1 : 1 мл ледяной уксусной кислоты, 20 мл формалина 40%-го, 100 мл дистиллированной воды. Это жидкость Руге.

Реактив №2 : протрава - танин (5 г), фенол кристаллический (1 г) и дистиллированная вода (100 мл).

Реактив №3 (реактив для серебрения): азотнокислое серебро - 5 г, раствор аммиака, вода дистиллированная - 100 мл. К 3-4 мл 5%-го раствора азотнокислого серебра по каплям прибавляют раствор аммиака до помутнения и образования осадка, а затем осторожно до растворения осадка. После этого вновь прибавляют раствор серебра до появления легкой опалесценции. Полученный раствор аммиачного серебра разводят дистиллированной водой в 10 раз.

Д. Окраска включений клеток микроорганизмов

Окраска гликогена. Гликоген - животный крахмал часто накапливается в клетках дрожжей, бацилл. Для выявления гликогена к капле суспензии клеток на предметном стекле добавляют каплю раствора Люголя. Препарат покрывают покровным стеклом и микроскопируют гранулы гликогеноподобных веществ, окрашенные в красновато-коричневый цвет.

Окраска гранулёзы. Гранулеза - крахмалоподобное вещество. Гранулеза в больших количествах накапливается в клетках маслянокислых бактерий. Анализ проводят аналогично выявлению гликогена. Гранулеза окрашивается в синий цвет.

Окраска жира. Жир содержится в клетках почти всех микроорганизмов, особенно много его накапливается при старении культуры.

На предметное стекло наносят небольшую каплю 40%-го раствора формалина. Петлей в каплю вносят культуру микроба. Формалин убивает клетку и разрыхляет оболочку. Через 5 минут добавляют каплю метиленового синего и спустя 10 минут каплю судана III - индикатора жироподобных веществ. Образовавшуюся общую каплю накрывают покровным стеклом, удаляют избыток жидкости фильтровальной бумагой и микроскопируют с иммерсией. Цитоплазма клеток окрашиваются в синий цвет, включения жира - в розово-оранжевый.

Бактерии в качестве резервных липидов образуют гранулы поли-бета-оксимасляной кислоты. Для их выявления готовят фиксированный мазок, окрашивают суданом черным или суданом III в течение 5-15 минут (краситель при этом может высохнуть, но это не имеет значения). Затем краситель смывают, препарат подсушивают фильтровальной бумагой и обрабатывают ксилолом, несколько раз погружая в него препарат. Время просветления препарата в ксилоле не должно превышать 1 минуту. После этого клетки дополнительно окрашивают 0,5%-м раствором сафранина в течение 5-10 сек. Включения поли-бета-оксимасляной кислоты выглядят как черно-синие гранулы в розовой цитоплазме клеток.

Окраска полифосфатов (волютин, метахроматин). На тонкий, зафиксированный на горелке мазок, наносят метиленовую синь по Леффлеру и окрашивают в течение 10 минут. Краситель сливают, промывают, просушивают, микроскопируют с иммерсией. Клетки окрашиваются в голубой цвет, а зерна волютин - в фиолетово-красный.

Окраска волютина по Омелянскому. На фиксированный в пламени мазок наносят фуксин Циля и окрашивают клетки 0,5-1 минуту. Промывают препарат водой и обесцвечивают 1%-м раствором серной кислоты в течение 20-30 сек. Кислоту сливают, мазок промывают водой и дополнительно докрашивают метиленовым синим (в разведении 1:40) 20-30 сек. Препарат вновь промывают, высушивают, микроскопируют с иммерсией. При правильном окрашивании гранулы волютина имеют красный цвет и хорошо видны на фоне синей цитоплазмы.

Окраска волютина по Муромцеву. Тонкий фиксированный смазок культуры микроба окрашивают краской по Муромцеву 1 минуту. Мазок промывают водой, сушат и микроскопируют с иммерсией. Зёрна волютина окрашиваются в фиолетовый цвет, цитоплазма - в голубой.

Препараты для окрашивания включений.

1. Раствор Люголя для выявления гликогена и гранулезы: йод кристаллический - 1 г, калий йодистый - 3 г, вода дистиллированная - 300 мл.

2. Судан III - 0,5 г, молочная кислота концентрированная - 100 мл.

2-а. 0,1 г судана III растворяют в 200 мл 96%-го спирта или концентрированной молочной кислоты.

3. Судан черный В - 0,3 г, 100 мл 70%-го горячего этилового спирта. Раствор выдерживают несколько часов в закупоренной склянке при 60°С, затем охлаждают и фильтруют.

4. Метиленовый синий 1:40. Насыщенный спиртовой раствор метиленового синего - 1 мл, вода дистиллированная - 40 мл.

Е. Выявление нуклеоида и приготовление реактивов

а) Методы выявления

Метод Романовского-Гимза. Препарат фиксируют метиловым спиртом или фиксатором Карнуа. В последнем случае для удаления следов уксусной кислоты препарат промывают этиловым спиртом и тщательно высушивают на воздухе. Окрашивают препарат красителем Романовского-Гимза в течение суток, затем ополаскивают слабощелочной водой (pH 7,2), высушивают и микроскопируют с иммерсией. Ядерные вещества окрашиваются в красно-фиолетовый цвет, цитоплазма - в слабо-розовый.

Реакция Фельгена. Препарат обрабатывают фиксатором Карнуа в течение 5 мин., промывают абсолютным спиртом, гидролизуют 7 минут в растворе 1н. соляной кислоты, подогретой до 60°С, погружают на 1-2 минуты в холодную 1н. соляную кислоту и переносят в фуксинсернистую кислоту (реактив Шиффа) на 3-4 часа. Препараты последовательно промывают в трех кюветах с сернистой водой по 20 минут в каждой, затем споласкивают дистиллированной водой, высушивают и микроскопируют. Ядерное вещество окрашивается в фиолетовый цвет.

Модификация метода Фельгена. После гидролиза в соляной кислоте препарат немедленно промывают водой и помещают на 15 минут в 1%-й раствор формалина. Вновь промывают водой и окрашивают в течение 1-2 минут 0,1-1%-м водным раствором основного фуксина. Препарат промывают, высушивают, исследуют с иммерсией. Цитоплазма окрашивается в розовый цвет, нуклеоид - в ярко-малиновый.

б) Реактивы для выявления нуклеоида.

1. Фиксатор Карнуа: 96%-й этиловый спирт - 60 мл, хлороформ - 30 мл, ледяная уксусная кислота - 10 мл (время фиксации - 15 минут).

2. Краситель Романовского-Гимза: состоит из смеси азура, эозина и метиленового синего. Перед употреблением к 10 мл красителя добавляют 10 мл дистиллированной воды (pH 7,2).

3. 1н. соляная кислота.