Corynebacterium spp – бактерия-возбудитель дифтерии. Коринебактерии

Реже - в других органах, и явлениями интоксикации (поражение сердечно-сосудистой, кортикоадреналовой систем и периферических нервов). Механизм передачи - респираторный. Источник инфекции - больные и носители токсигенных штаммов С. diphtheriae.

Полиморфные прямые или слегка изогнутые палочки (0,3-0,8 х 1,5-8 мкм), иногда с булавовидными концами (Corynebacterium от греч. koryne - булава). Располагаются в виде буквы «V». Грамположительные. По полюсам клеток видны зерна полиметафосфата (зерна волютина), обладающие метахромазией, т. е. окрашиваются метиленовым синим или по Нейссеру в иной цвет, чем бактерия (рис. 3.87 и 3.88).

Рис. 3.87. Рисунок мазка из чистой культуры С diphtheriae . Окраска по Нейссеру

Таблица З.Зб. Коринебактерии, наиболее клинически значимые в патологии человека
Виды рода Corynebacterium
	Дифтерия
	Ангина у иммунодефицитных лиц
С. jeikeium (группа JK)	Септицемия, инфекции мягких тканей
С. urealyticum (группа D2)	Инфекции мочевого тракта (пиелонефрит, цистит и др. оппортунистические инфекции)
С. minutissimum	Эритразма, оппортунистические инфекции
	Оппортунистические инфекции
С. pseudodiphtheriticum	Эндокардит, оппортунистические инфекции
	Оппортунистические инфекции
Arcanobacterium (ранее Corynebacterium) haemolyticum	Хронические тонзилиты, поражения кожи

С. ulcerans - вид мелких палочковидных грамположительных бактерий рода Corynebacterium. Иногда из-за наличия профага продуцирует дифтериеподобный экзотоксин. Штаммы С. ulcerans продуцируют также фосфолипазу D. Представители вида родственны С. diphtheriae. Являются патогенами для крупного рогатого скота. Возможно заражение человека через молоко больных коров. Вызывают дифтериеподобные заболевания, фарингит, поражения кожи у лиц с иммунодефицитами.

Рис. 3.88 . Мазок из чистой культуры С. diphtheriae . Окраска щелочной синькой Леффлера

Имеют микрокапсулу. Неподвижны. Факультативные анаэробы. Выделяют 4 биовара: gravis, mitis, intermedius, belfanti.

Рис. 3.89. Колонии С. diphtheriae gravis (слева) - крупные матовые, выпуклые в центре с радиальной исчерчеиностыо и неровными краями («маргаритки») и mitis (справа) - мелкие, черные, гладкие, блестящие с ровными краями

Дифтерийные палочки могут быть токсигенными (продуцирующими экзотоксин) и нетоксигенными. Образование экзотоксина зависит от наличия в бактериях профага, несущего tox-ген, кодирующий образование токсина. При заболевании все изоляты тестируются на токсигенность - продукцию дифтерийного экзотоксина (см. реакция преципитации).

Микробиологическая диагностика . Исследуют слизь и пленку из очагов поражения. Бактериоскопический метод имеет ориентировочное значение: мазок окрашивают щелочной метиленовой синькой Леффлера или уксусно-кислой толуидиновой синькой, а другой мазок - по Граму. Зерна волютина метахроматически окрашиваются метиленовым синим в темно-бордовый цвет (клетка окрашивается в синий цвет). Бактериологический метод: посев на среду Клауберга И, хинозольную среду Бучина, модифицированную среду Тинсдаля (цистин-теллурит-сывороточная среда), кровяной агар, на плотную сывороточную среду для выявления продукции цистиназы (проба Пизу - коричневый ореол вокруг посева «уколом»), на среды Гисса, на среду для определения токсигенности возбудителя (преципитация в геле) и др. Молекулярно-генетический метод: ПЦР.

Специфическая профилактика. В качестве вакцины применяют дифтерийный анатоксин, входящий в состав препаратов АКДС (адсорбированная коклюшно-дифтерийно-столбнячная вакцина), АДС и АД. Препарат вводится грудным детям, начиная с трехмесячного возраста. Ревакцинацию проводят с помощью АДС. Людям, ранее иммунизированным, но не имеющим достаточно напряженного антитоксического иммунитета, при контакте с больными вводят дифтерийный анатоксин. Ранее неиммунизированным - дифтерийный анатоксин + антитоксическую сыворотку. Последную, как и при лечении, вводят дробно по Безредке (профилактика анафилактического шока).

Коринебактерии. Микробиологическая диагностика дифтерии .

М и кобактер ии . Лабораторна я д и агностика туберкул е з а .

Род Corynebacterium объединяет бактерии, имеющие булавовидные утолщения на концах (от лат. согупе - булава), окрашивающиеся по Граму положительно. К ним относятся врзбудители дифтерии (Corynebacteruim diphtheriae), листериоза (Listeria monocytogenes) и ряд сапрофитных коринебактерий - дифтероиды и ложно- дифтерийная палочка Гоффмана, которые встречаются на слизистых оболочках и коже человека.

Коринебактерий дифтерии

Возбудитель дифтерии - Corynebacterium diphtheriae. Открыт в 1883 ‑ 1884 гг. Клебсом и Леффлером.

Морфология и биологические свойства. Коринебактерии дифтерии - слегка изогнутые небольшие тонкие палочки размером 0,3-0,4*4-5 мкм, с небольшими булавовидными утолщениями на концах, в которых находятся зерна волютина. Спор и капсул не образуют, неподвижны. Характерными признаками этих бактерий являются полиморфизм (наличие, помимо типичных палочек, длинных, коротких, ветвящихся форм, грушевидных), метахромазия (неравномерное окрашивание тела в связи с более интенсивно окрашивающимися зернами волютина) и расположение палочек в мазке под углом друг к другу, в виде «растопыренных пальцев», горсти булавок. Грамположительны. Зерна волютина хорошо выявляются при окраске по Иейссеру: тело бактерий окрашивается в темно-желтый, а зерна волютина - в темно-синий цвет. В носоглотке часто обнаруживаются ложнодифтерийные палочки Гоффмана, более короткие и толстые, чем дифтерийные, и находящиеся в мазках параллельно друг другу в виде частокола; зерна волютина у них обнаруживаются редко и располагаются беспорядочно.

Возбудитель дифтерии - факультативный аэроб. Температурный оптимум 37°С, рН 7,6-7,8. На простых питательных средах растет плохо. Для выращивания используют элективные сывороточные среды (Ру и Леффлера) и среды с теллуритом калия: кровяно-тёллуритовые (среда Клауберга), сывороточно-теллуритовые (среда/Гинсдаля), хинозольная среда Бучина. Коринебактерии дифтерии при росте на теллуритовых средах восстанавливают металлический теллур из теллурита калия, поэтому колонии их темного цвета. На чашке со средой Бучина колонии дифтерийных бактерий окрашены в синий цвет. Колонии на средах Ру и Леффлера выпуклые, блестящие, их рост напоминает шагреневую кожу. На бульоне Мартена характерен рост в виде пленки.

По культуральным, ферментативным и другим свойствам различают три типа коринебактерий дифтерии: gravis, mitis, intermedius. На теллуритовых средах бактерии типа gravis образуют колонии плоские, крупные, с радиальной исчерченностью и зубчатыми краями, серовато-черного цвета. Колонии коринебактерий дифтерии типа mitis более мелкие, выпуклые, блестящие, гладкие, черного цвета. Тип intermedius занимает промежуточное положение. Биохимические свойства дифтерийных бактерий позволяют дифференцировать их от непатогенных представителей рода Corynebacterium, а также разделить на типы .

Коринебактерии дифтерии ферментируют глюкозу, мальтозу, галактозу до кислоты, не изменяют лактозу, сахарозу, маннит, не разлагают мочевину (проба на уреазу), продуцируют фермент цистиназу (проба Пизу). Бактерии типа gravis ферментируют крахмал, а типа mitis не ферментируют.

Токсинообразование. Дифтерийные бактерии образуют сильный экзотоксин, который при введении в организм избирательно поражает сердечную мышцу, надпочечники и периферическую нервную систему. Дифтерийный токсин - простой белок, состоящий из двух фракций: фракция А связана с токсической функцией, фракция В - с функцией прикрепления токсина к чувствительным клеткам организма. Силу токсина определяют на морских свинках и измеряют минимальной смертельной дозой (Dim), убивающей животное массой 250 г в течение 4 дней. Дифтерийный токсин малоустойчив, легко разрушается при 60°С под действием солнечного света и различных химических веществ. Под влиянием 0,3-0,4% формалина и выдерживания при 40°С в течение месяца превращается в не ядовитое соединение - анатоксин. Анатоксин сохраняет иммуногенные свойства и его используют для иммунизации людей.

Ранее считали, что токсигенным является тип gravis, а тип mitis нетоксигенен. Однако в последние годы установлено, что бактерии типов как gravis, так и mitis могуг быть и токсигенными, и нетоксигенными.

Устойчивость. Дифтерийные бактерии довольно устойчивы к низкой температуре. В высушенной дифтерийной пленке остаются жизнеспособными 3-4 мес, на различных предметах и одежде сохраняются много дней. Чувствительны к действию высоких температур: при кипячении погибают мгновенно, при 60°С - в течение 10 мин. Быстро гибнут при действии прямого солнечного света, дезинфицирующих растворов: 3-5% раствор карболовой кислоты убивает их в течение минуты.

Антигенная структура у дифтерийных бактерий изучена недостаточно. Описано 11 серологических типов, отличающихся между собой в реакции агглютинации со специфическими типовыми дифтерийными сыворотками.

У возбудителей дифтерии изучены типовые фаги, с помощью которых производят фаготипирование выделенных штаммов, что имеет большое значение в эпидемиологической практике для выявления источника инфекции.

Патогенность. Животные дифтерией не болеют. В экспериментальных условиях наиболее чувствительны к заражению морские свинки и кролики. При подкожном введении морским свинкам культуры или токсина развивается картина токсикоинфекции, на месте инъекции возникают воспаление и некроз, а затем животное гибнет.

Патогенез и клиника. Входными воротами дифтерийных микробов являются слизистые оболочки носоглотки, иногда глаз, половых органов (у девочек), кожа и раны. Инкубационный период равен 3-10 дням. Микроб локализуется на месте входных ворот, где возникает местное фибринозное воспаление и образуются дифтеритические пленки серовато-желтого цвета, тесно спаянные с подслизистым слоем. Иногда процесс со слизистой оболочки глотки распространяется на гортань и бронхи, что сопровождается отеком, сужением гортани и может привести к асфиксии.

В месте своего внедрения возбудители дифтерии размножаются, выделяют экзотоксин, который всасывается в кровь и обусловливает тяжелую общую интоксикацию организма, избирательно поражая сердечную мышцу, надпочечники, нервные клетки. Таким образом, дифтерия- типичная токсинемическая инфекция. Клиническая» тяжесть заболевания зависит от степени токсигенности штамма.

Иммунитет. После перенесенной инфекции стойкий, хотя возможны повторные заболевания. Формирование иммунитета связано с накоплением в крови антитоксина. Антитоксин к дифтерийному токсину обнаруживают у детей до 6-месячного возраста в результате передачи его с кровью матери через плаценту. У взрослых, он также накапливается вследствие постоянной «бытовой» иммунизации. О состоянии иммунитета к дифтерии можно судить по реакции Шика. Для этого во внутреннюю поверхность предплечья внутрикожно вводят 1/40 Dlm дифтерийного токсина. Токсин перед введением разводят таким образом, чтобы данная доза содержалась в объеме 0,2 мл. Для контроля в другую руку вводят прокипяченный токсин. При отсутствии иммунитета на месте введения токсина через 2-3 дня появляются краснота и припухлость диаметром до 2 см. Если же ребенок невосприимчив к дифтерии, реакция будет отрицательной вследствие нейтрализации введенного токсина содержащимся в крови антитоксином.

В настоящее время применение реакции Шика ограничено и ее используют только по эпидемиологическим показаниям.

Микробиологическая диагностика. Лабораторное исследование проводят с целью ранней диагностики заболевания и выявления бактерионосителей среди здоровых лиц. Материалом для исследования служат дифтеритическая пленка или отделяемое из мест поражения, а также слизь из носа и глотки. Материал берут стерильным ватным тампоном и немедленно отправляют в лабораторию. Если материал не может быть засеян в течение ближайших 3-4 ч, то во избежание снижения высеваемости его берут тампоном, смоченным 5% раствором глицерина в изотоническом растворе хлорида натрия. С этой же целью материал забирают тампоном, смоченным 2% раствором теллурита калия.

Основным методом диагностики является микробиологический.

Первый день. Посев производят на чашки со средой Клауберга или Тинсдаля, а также на среду Бучина. При необходимости, по требованию врача, берут материал еще одним тампоном для микроскопического исследования. С тампона делают мазок, окрашивают его по Граму и по Нейссеру.

Второй день. Через 18-24 ч инкубации в термостате просматривают посевы. На средах с теллуритом калия колонии дифтерийных бактерий окрашены в черный цвет разной степени интенсивности. Колонии дифтероидов влажные, выпуклые, коричневого или серого цвета.
На среде Бучина колонии возбудителей дифтерии синего цвета, дифтероидов - бесцветные, а палочек Гоффмана - голубоватые. Для выделения чистой культуры часть отдельно лежащей подозрительной колонии пересевают на скошенный сывороточный агар, или свернутую сыворотку (среда Ру или Леффлера). Вторую половину колонии пересевают в виде бляшки на поверхность среды, для определения токсигенности и, не прожигая петли, производят посев уколом в пробирку со столбиком питательной среды с цистином (проба Пизу) для выявления фермента цистиназы.

Токсигенность выделенной культуры в настоящее время определяют методом диффузионной преципитации в геле.

Третий день. Со скошенного сывороточного агара или свернутой сыворотки приготовляют мазок, окрашивают, по Нейссеру, микроскопируют. Учитывают токсигенность. - Отмечают появление коричневого облачка вокруг темного стержня по ходу укола в среде Пизу, что характерно для роста дифтерийных микробов. Для изучения ферментативных свойств и установления типа возбудителя дифтерии производят посев в среды Гисса с глюкозой, сахарозой, крахмалом и в среду с мочевиной для определения наличия уреазы.

Четвертый день. Окончательный положительный ответ дают при наличии типичных дифтерийных бактерий в мазках из чистой культуры, характерных колоний на Средах с теллуритом калия, результата пробы на токсигенность и определения ферментативных свойств. Принадлежность выделенной культуры к виду Corynebacterium diphtheriae можно установить в реакции агглютинации с поливалентной дифтерийной сывороткой. Однако многие нетоксигенные штаммы возбудителей дифтерии не агглютинируются этой сывороткой. С помощью типовых агглютинирующих дифтерийных сывороток можно установить серологический тип возбудителя.

Для ускоренной диагностики дифтерии стерильный ватный тампон смачивают нативной сывороткой, которую свертывают на тампоне нагреванием при 80°С. Сывороточным тампоном берут мазок из патологического очага и инкубируют в термостате в течение 3-4 ч. Затем делают мазки, окрашивают их по Нейссеру. У больных дифтерией обнаруживается значительное число возбудителя в мазках.

Профилактика и лечение. Для предупреждения распространения дифтерии необходимы ранняя диагностика заболевания, госпитализация больных, дезинфекция, выявление носителей дифтерийных микробов среди детей и лиц, работающих в детских учреждениях. Специфическую профилактику осуществляют введением дифтерийного анатоксина для создания активного иммунитета против дифтерии. В настоящее время в Советском Союзе проводят обязательную вакцинацию детей комплексной вакциной АКДС, в состав которой входят, помимо дифтерийного, столбнячный анатоксин и взвесь убитых коклюшных бактерий. Для ревакцинации используют вакцину АДС-М (без коклюшных бактерий) с уменьшенным содержанием анатоксинов. В особых случаях детям, контактировавшим с больным дифтерией, для создания кратковременного пассивного иммунитета вводят наряду с анатоксином противодифтерийную антитоксическую сыворотку.

Для лечения применяют противодифтерийную антитоксическую сыворотку в дозе 1000-5000 АЕ на 1 кг массы тела ребенка. Раннее введение сыворотки имеет часто решающее значение в исходе болезни. Одновременно назначают антибиотики тетрациклинового ряда, пенициллин, сульфаниламидные препараты. Применяют также сердечные средства, витамины, переливание крови и др.

С. diphtheriae обнаружен в 1883 г. Э. Клебсом, выделен в чистой культуре Ф. Леффлером в 1884 г.

Морфология, физиология. Коринебактерий дифтерии - пря­ мые или слегка изогнутые палочки, длиной 1-8 мкм, шириной 0,3-0,8 мкм. В препаратах микроорганизмы располагают под углом друг к другу в виде букв L , V или китайских иероглифов. Зерна волютина., расположенные на концах палочек, выявляются при окраске синькой Леффлера или по методу Нейс сера. Дифтерийные палочки - факультативные анаэробы, хорошо размножаются при свободном доступе кислорода. К питательным средам требовательны: не способны утилизировать азот из ам­ монийных соединений и требу­ют наличия почти всех ами­ нокислот, солей магния, цинка, меди, железа; для культивиро­вания необходимы углеводы. Этим потребностям удовлетво­ряют питательные среды, полу­ ченные на основе фермента­тивного расщепления белка (казеина, дрожжей) с добав­ лением крови или сыворотки. На поверхности плотных сред с теллуритом калия дифтерий- ные палочки образуют темно-серые или черные колонии (гравис или митис), что служит основой для подразделения этого вида бактерий на биовары. Рост на скошенном сывороточном агаре сравнивают с шагреневой кожей - колонии не сливаются.

Коринебактерии дифтерии.

Corynebacterium diphtheriae, окраска по Грам у

окраска по Нейссеру

Corynebacterium diphtheriae, окраска по Леффлеру

По культуральным свойствам коринебактерии дифтерии разделяются на биовары gravis , mitis, intermedius .

Коринебактерии gravis на телуритовом агаре, который содержит дефибринированную кровь и теллурит калия, образуют крупные шероховатые (R-формы) розетковидные колонии черного или серого цвета. Они ферментируют декстрин, крахмал и гликоген, в бульйоне образуют поверхностную пленку и зернистый осадок, обычно высокотоксичные и имеют более выраженныеинвазивныесвойства.

Коринебактерии mitis на телуровом агаре растут с образованием темных гладких (S-формы) и блестящих колоний. Они не ферментують крахмал и гликоген, непостоянно ферментують декстрин, вызывают гемолиз эритроцитов всех видов животных, в бульйоне даюгь диффузное помутнение, менее токсичные и инвазивные.

Ферментативные свойства . Коринебактерии дифтерии не разлагают мочевину, не выделяют индол, слабо образуют сероводород, восстанавливают нитраты в нитриты, а также теллурит калия к металлу, в результате чего колонии возбудителя дифтерии на телуровом агаре становятся черными или серыми. Коринебактерии дифтерии ферментируют глюкозу и мальтозу, непостоянно - галактозу, крахмал, декстрин,глицерин.

Токсинообразование. Коринебактерии дифтерии продуцируют в бульйонных культурах сильные экзотоксины (гистотоксин, дермонекротизин, гемолизин). Токсигенность коринебактерий связана с лизогенностью (наличием в токсигенних штаммах умеренных фагов - профага). Классический международный эталонный штамм Вильямс Парка 8 - продуцент экзотоксина - также лизогенный и свыше 85 лет сохраняет свойство токсинообразования. Генетические детерминанты токсигенности (tox + -гены) локализованы в геноме профага, интегрированного с нуклеоидом коринебактерий дифтерии.

Дифтерийный экзотоксин состоит из двух (А и В) полипептидных цепей, соединенных дисульфидным мостиком. Под воздействием восстановительных агентов расщепляются дисульфидные связи, которые соединяют А- и В-цепи. А-цепь переходит в цитоплазму, а В-цепь остается в мембране эндосомы и вызывает связывание токсина с рецепторами на поверхности клеток.

Дифтерийный токсин неустойчив, легко разрушается под воздействием температуры, света и кислорода воздуха, но сравнительно резистентный к действию ультразвука. После добавления к токсину 0,3-0,4 % формалина и последующего выдерживания при температуре 38-40 °Св течение З-4 недель он превращается в анатоксин, который имеет большую стойкость относительно физических и химических воздействий, чем исходный токсин.

Коринебактерии дифтерии продуцируют бактериоцины (коринецины), которые предоставляют им некоторых селективные преимущества.

Коринебактерии лизируются вирулентными фагами. Они спе­ цифичны для отдельных видов. Созданная коллекция коринефа говпозволяетустанавливатьфаговарыисследуемых культур.

Антигены. С. diphtheriae имеют белковую поверхностную структуру - микрокапсулу, которая содержит К-антиген. Опре­ деление этого антигена позволяет установить серовар (их более 10). Группоспецифический полисахаридный антиген кле­ точной стенки дает перекрестные серологические реакции с ми- кобактериями, нокардиями.

Экология и распространение. С. diphtheriae обитают в орга­низме больного человека или носителя. Инфекция передается аэрозольным путем. В настоящее время дифтерия «постарела», зарегистрированы многочисленные случаи заболеваний у взрос­лых, которые протекают в тяжелой форме. Токсигенность дифтерийных бактерий связана с их лизогенизацией специфичес­ ким профагом. Выделяясь в окружающую среду со слюной, пленками, дифтерийные палочки сохраняют жизнеспо­ собность в течение нескольких дней на посуде, игрушках, других предметах. Эти микроорганизмы хорошо переносят высушива­ ние - в пыли могут не погибать в течение 5 мес. К дезинфи­цирующим растворам чувствительны: 5 % раствор карболовой кислоты губит их в течение 1 мин, 1 % раствор фенола - за 10 мин. Коринебактерии чувствительны к пенициллину, тетра- циклинам, эритромицину.

Патогенность возбудителя и патогенез дифтерии. Основной механизм передачи возбудителя дифтерии - воздушно-капель­ ный. Возможно также заражение через предметы, пищевые продукты, инфицированные дифтерийными палочками. Заболе­вание развивается у лиц, не имеющих антитоксического им­ мунитета.

На месте внедрения (зев, гортань, трахея, реже - нос, ухо, половые органы девочек, конъюнктива глаза) развивается местный воспалительный процесс. Все виды коринебактерии, па­ тогенные для животных, обладают фимбриями, которые обеспе­ чивают микроорганизмам адгезию к клеткам хозяина. Выявляют­ся фимбрии в реакции агглютинации трипсинизированных бараньих эритроцитов.

Основное свойство возбудителя дифтерии - токсигенность - способность секретировать гистотоксин, действие которого про­ является не только локально в виде воспалительной реакции, но и в общей интоксикации организма, поражении особенно чувствительных к нему надпочечников, миокарда, нервной систе­ мы. Токсин, блокируя ферменты синтеза белка в клетках хо­ зяина, приводит их к гибели, что обусловливает некроз и ле­ тальный исход.

Ферменты, выделяемые дифтерийной палочкой (гиалуронидаза, нейраминидаза, фибринолизин), обеспечивают микроорганиз­ мам распространение в тканях, но в отличие от токсинемии бактериемия клинически не проявляется. Возможно, что фермен­ты, продуцируемые атоксигенными штаммами дифтерийных кори­ небактерии, позволяют им персистировать в организме человека.

Корд-фактор (димиколат трегалозы), которым обладают воз­ будители дифтерии, нарушает фосфорилирование и процессы дыхания клеток макроорганизма.

Кл и н и ч еские прояв ления дифтер ии :

Дифтерия носа

Дифтер и йн ые пл енки на ми нд али н ах

Дифтер и я ротоглотки и гортан и

Взятие и доставка материала в лабораторию. Материалом для исследования является пленка с миндалин, дужек, неба, язычка, слизь с зева и носам,выделения из глаза, уха, раны, влагалища, пораженного участка кожи. По требованию эпидемиолога исследуют смывы с игрушек и других предметов, некоторые пищевые продукты (молоко, мороженое и тому подобное). Материал нужно брать к началу этиотропного лечения натощак или через 2 час после приема еды.

Для взятия материала используют тампоны, сухие или предварительно смоченные 5 % раствором глицерина, помещенные в пробирку и простерилизированные вместе с ней. Исследуемый материал из ротоглотки и носа берут двумя отдельными тампонами, пытаясь взять его на грани здорового и пораженного участка вращательными движениями, не касаясь тампоном слизистой щек, зубов и языка, который прижимают шпателем. При ларингоскопии пленку или слизь берут непосредственно из гортани. Пленки и слизь из рта и носа берут обязательно во всех случаях, даже при дифтерии других локализаций (кожа, рана, глаз, ухо, вульва).

Если необходимо провести первичную бактериоскопию по требованию врача, материал берут отдельным (дополнительным) тампоном или направляют часть снятой пленки, тщательным образом растертой между двумя предметными стеклами.

Тампоны после забора материала помещают в те же пробирки, на которых надписывают номер, дату и время забора, фамилию врача. Они должны быть доставлены в лабораторию не позже 3-х час после взятия материала. Если схема забора предусматривает посев возле кровати больного, то пробирки и чашки с посевами немедленно направляют в лабораторию или инкубируют при 37 °С и доставляютчерез 20-23 час, в холодную пору в сумках с грелками.

Бактериоскопическое исследование материала от больного проводят лишь по требованию врача и только для того, чтобы распознать некротическую ангину Симановского-Плаута-Венсана (выявление веретенообразных палочек и спирохет Венсана, которые при обычных методах культивирования не растут).

На протяжении многих лет микроскопическое исследование и выявление зерен валютина, окрашенных по Леффлеру и Нейссеру, было основой лабораторной диагностики дифтерии и выявления бактерионосительства. Теперь, в связи с изменчивостью дифтерийных бактерий под воздействием антибиотиков, первичная микроскопия исследуемого материала не рекомендуется.

Бактериоскопическое исследование проводится с целью идентификации нетипичных колоний на кровяно-телуритовых средах и при проверке чистоты выделенных культур. Мазки окрашивают по Граму, Леффлеру и Нейссеру. Можно также красить их уксуснокислым метиловым фиолетовым, толуидиновым синим или бентиазоловым и тиазиновым красителями.

Бактериологическое исследование . Клинический материал засевают на кровяной агар и кровяно-телуритовий агар (или среда Клауберга ІІ), разлитые в чашки Петри. Кроме того, некоторые штаммы C.diphtheriae чувствительные к действию теллурита калию, потому их рост на телуритових средах может подавляться. Для выявления дифтерийного бактерионосительства посевы производят только на кровяно-телуритовий агар, поскольку в посевном материале может содержаться небольшое количество дифтерийных палочек, рост которых на неселективных средах будет подавляться другой микрофлорой. При этом допускается использование и транспортной среды.

Кровяно-теллури т овый агар. К 100 мл 2 % расплавленного и охлажденного 50 °С питательного агара рН 7,6 добавляют 10-15 мл дефибринованой крови и 2 мл 2 % раствора теллурита калию. Смесь тщательным образом перемешивают и разливают в стерильные чашки Петри слоем толщиной 3- 4 мм

У C . diphtheriae выделяют три биовара - gravis , mitis , intermedius

Бактерии биовара gravis - короткие, неправильной формы, с небольшим количеством метахроматических гранул.

Биовар mitis образует длинные согнутые полиморфные палочки, которые содержат много волютинових зерен (тельца Бебеша-Эрнста)

Бактерии биовара intermedius наиболее длинные с бочкообразными контурами, для них характерны поперечные перегородки, которые разделяют клетку на несколько сегментов.В настоящем биовар intermedius относят в группу gravis.

Ро ст на кровяном агар е (біовар intermedius )

Б и овар gravisБ и овар mitis

(р о ст на кровяном агар е )

Среда Клауберга ІІ. К 100 мл 3 % питательного агара рН 7,6, расплавленного и охлажденного 50 °С, добавляют 3 мл 2 % раствора теллурита калия, 10 мл глицериновой смеси и 50 мл гемолизированной крови. Глицериновую смесь готовят путем добавления 20 мл стерильного глицерина до 40 мл дефибринованой крови. Смесь можно хранить в холодильнике на протяжении 4-х месяцев. Для приготовления гемолизированной ("лаковой") крови до 34 мл стерильной дистиллированной воды добавляют 16 мл дефибринованой крови.

Транспортная полужидкая среда. К 100 мл перевара Хоттингера или мясо-пептонного бульйона добавляют 1 г любого коммерческого агара, устанавливают рН 7,6, стерилизуют в автоклаве при 112 °С 30 хв, асептически добавляют 10 мл сыворотки и 1 мл 2 % теллурита калия. Среду разливают в пробирки по 5 мл. При возможности используют и более сложную транспортную среду ЕМЕС (AMIES), модифицировано Стюартом.

Посев от одного больного делают на одну чашку, используя при этом одну половину среды для посева из ротоглотки (миндалин, дужек, язычка), а вторую - для посева другим тампоном из носа. Если есть исследуемый материал из кожи, глаза, уха и других локализаций - добавляют еще одну чашку. Нельзя засевать материал от нескольких больных водну чашку. Среды перед посевом согревают в термостате 15-20 мин.

При посеве исследуемого материала его втирают тампоном сначала в отдельный участок кровяного агара площадью 2х1 см, потом аналогично на кровяно-телуритовом агаре (или среде Клауберга ІІ), при этом тампон все время вращают, чтобы засеять из него весь материал. Потом тем же тампоном штрихами засевают остальную поверхность среды (половину чашки). Такая техника посева позволяет получить изолированные колонии (чистую культуру), которые используют непосредственно из чашки для определения токсигенности и последующей их идентификации. Засеяные чашки или пробирки с транспортной средой инкубируют в термостате при 37 °С на протяжении 20-24 час.

На второй день с помощью стереоскопического микроскопа исследуют характер колоний. Если рост отсутствует на обеих средах делают повторный забор материала. Чашки с типичными и подозрительными на C.diphtheriae колониями отбирают для последующей идентификации культуры по всем тестам. Микроскопию подозрительных колоний можно и не проводить.

Культуральные свойства. Колонии дифтерийных палочек на кровяном агаре беловатого или желтоватого цвета, непрозрачные, круглой, слегка выпуклой формы, диаметром 1- 2 мм Обычно они имеют маслянистую консистенцию, хотя некоторые могут образовывать хрупкие шереховатые R-колонии.

На кровяно-телуритовых средах колонии C.diphtheriae через 24 час роста имеют серый цвет, выпуклые, с ровным краем, вязкие. Через 48 год они приобретают темносерый или черный цвет с металлическим блеском, ровными или слегка фестончатыми краями, гладкой и блестящей или с радиально исчерченой поверхностью (R-формы), вязкие или хрупкие при прикосновении петлей. По структуре 48-часовых колоний на телуритовых средах и некоторыми ферментативными признаками возбудителя дифтерии разделяют на четыре культурально-биохимических варианта (биовары) - gravis, mitis, belfanti, intermedius.

Если типичный рост отсутствует, из других, сомнительных, колоний готовят мазки. При выявленииспоровых палочек, коков, дрожжей и др., исследование на дифтерию прекращают и дают негативный ответ. Однако, важно помнить, что дифтерийные бактерии, которые образовали нетипичные колонии на средах с ингибиторами роста (теллурит калия), могут быть укорочены, утолщены, но сохраняют полиморфизм и характерное расположение.

При росте типичных колоний сразу же приступают к изучению их токсигенности и идентификации.

Токсигенные свойства. Исследуют не меньше 2-х изолированных колоний путем посева одной половины каждой колонии на среду для определения токсигенности и непрожженной петлей на среду Пизу, а второй половины - на скошенный сывороточный агар для выделения чистой культуры и сохранения ее к окончанию лабораторной диагностики. В случае, если на чашке вырастают одновременно токсигенные и нетоксигенные разновидности C. diphtheriaе, необходимо примножественном росте подозрительных колоний исследовать токсигенные свойства около 20 колоний, засевая в одну бляшку материал из 5-6 колоний. При росте лишь одной колонии ее засевают на среду для определения токсигенности и, не прожаривая петлю, - в пробирку со средой Пизу. Если применяли транспортную среду высев из нее делают на плотные кровяно-телуритовые среды.

На третий день при появлении специфических линий преципитации в агаровом геле и позитивной пробе на цистиназу выделенную культуру определяют как токсигенную С. diphtheriае. Если линии преципитации через 24 год отсутствуют, чашки инкубируют еще в течение суток. В случае негативной пробы Пизу культуру идентифицируют как другой вид коринебактерий.

Чистую культуру на скошенном сывороточном агаре высевают на углеводородные среды с глюкозой, сахарозой, растворимым крахмалом, ставят пробы на выявление уреазы, пиразинамидазы и нитратнедуктазы.

На четвертый день делают учет результатов всех посевов и выдают аргументированный бактериологический вывод о выделенной культуре.

Используют такие методы идентификации коринебактерий.

Определение токсигенности in vitro. В его основе лежит взаимодействие токсина с антитоксином в агаровом геле. В местах оптимального количественного соотношения токсина и антитоксина в толще агара выпадает преципитат в виде тонких нежных белых линий ("стрелы", "усики"). Этот тест во многих странах за рубежом называют Элек-тестом.

Пробу на токсигенность, как правило, проводят с чистыми культурами. Можно определить ее и с культурами, загрязненными сторонней микрофлорой, что на сутки убыстряет лабораторную диагностику дифтерии. Но при негативной пробе ее повторяют с выделенной чистой культурой.

Для постановки этой пробы микробиологическая промышленность выпускает специальную сухую стандартную среду для определения токсигенности дифтерийных микробов (ВТДМ) и стандартные бумажные диски, пропитанные антитоксической противодифтерийной сывороткой, и высушенные.

На поверхность свежеизготовленной среды ВТДМ накладывают бумажные диски с антитоксином (не более четырех на одну чашку). На расстоянии 0,5 см от диска вокруг него засевают культуры в виде "бляшек" диаметром 7- 8 мм, чередуя "бляшки" исследуемой культуры и контрольного штамма.

Результаты учитывают через 18-24 и 48 час. Критерием специфичности преципитатов является слияние линий преципитации исследуемой культуры с линиями токсигенного штамма. В таком случае выделенную культуру считают токсигенной.

При отсутствии стандартных бумажных дисков можно использовать полоски фильтровальной бумаги, пропитанные дифтерийным антитоксином. Их изготовляют непосредственно в лаборатории. Нарезанные по указанным размерам и простерилизированные в автоклаве при 121°С на протяжении 30 мин бумажные полоски смачивают 0,25 мл очищенного дифтерийного антитоксина, который содержит 500 МО в 1 мл. В таком случае на чашку с соответствующей средой кладут смоченную антитоксином полоску бумаги, подсушивают, открыв чашку на 15-20 мин в термостате и перевернув ее вверх дном. После этого с обеих сторон полоски засевают культуры "бляшками", чередуя исследуемые и контрольные штаммы.

Для определения токсигенности возбудителя дифтерии можно использовать также и другие среды (АГВ, мартеновский агар и т. п.), рецепты изготовления которых приведены в "Инструкции по бактериологической диагностике дифтерии", Киев (1999).

На протяжении многих лет токсигенность дифтерийных бактерий определяли подкожным или внутрикожным введением культуры двум гвинейским свинкам, одной из которых накануне вводят 100-1000 МО антитоксической противодифтерийной сыворотки. Теперь этот метод бактериологические лаборатории практически почти не используют из-за его дороговизны и значительной задержки ответа.

Изучение токсигенности внутрикожным введением культуры

гвинейской свинке

В последнее время разработан очень чувствительный и высокоспецифический метод определения гена дифтерийного токсина путем цепной полимеризной реакции. Он основан на определении участка ДНК C. diphtheriaе, где локализован ген дифтерийного токсина, с помощью ДНК-ПОЛИМЕРАЗЫ. Метод имеет преимущества перед традиционным определением токсигенности: высокую чувствительность, скорость получения результатов (4-6 час), не нуждается в выделении чистой культуры.

Но для его проведения необходимы специальная аппаратура, дорогие реактивы и соответствующее помещение, а потому может быть проведен лишь в специализированной лаборатории

Ферментативные свойства. Определение цистинази (проба Пизу). C. diphtheriaе, C. ulcerans,C. Pseudotuberculosis выделяют фермент цистиназу, псевдодифтерийные бактерии и другие дифтероиды его не продуцируют.

Выделенную культуру засевают уколом в среду с цистином, разлитую столбиком в узкие пробирки. Цистиназоположительные бактерии расщепляют цистин с выделением сероводорода, который с уксуснокислым свинцом, имеющимся всреде, образует сернокислый свинец, в результате чего среда окрашивается в темно-коричневый цвет. C. diphtheriaе вызывает не только потемнение среды по ходу укола но и образует вокруг него "тучку" темно-коричневого цвета на расстоянии 1 см от поверхности.

Результаты учитывают через 20-24 час инкубации в термостате.

Определение уреазы (проба Закса) . Дифтерийные бактерии этого фермента не образуют. Позитивную пробу на уреазу дают лишь некоторые другие виды коринебактерий. Для постановки пробы выделенную культуру сеют на бульйон с мочевиной. Уреаза разлагает мочевину, изменяет рН среды, что сопровождается его покраснением. Если фермент не выделяется, изменение расцветки бульйона не происходит.

Определения пиразинамидазы проводят путем гидролиза пиразинамида до пиразиновой кислоты и аммония. Для этого в стерильную пробирку вливают 0,25 мл стерильной дистиллированной воды, в которой готовят густую взвесь выделенной культуры, потом вносят одну диагностическую таблетку Rosko 598-21.Инкубируют на протяжении 4-х час при 37 °С, после чего добавляют одну каплю только что приготовленного 5 % водного раствора сульфата аммонийного железа. При наличии фермента суспензия приобретает красный или оранжевый цвет.

Патогенные коринебактерии не выделяют пиразинамидазу, а следовательно и не изменяют цвет суспензии.Сахаролитические ферменты определяют путем посева полной петли выделенной культуры в каждую пробирку короткого пестрого ряда Гиса (глюкоза, сахароза, растворимый крахмал). Результаты учитывают через 24 час инкубации в термостате. Расщепление крахмала может задерживаться до 48 час.

Определение нитратредуктазы является дополнительным тестом для идентификации С. belfanti и C. ulcerans, которые не образуют этого фермента. В пробирку с бульйоном, к которому добавляют 0,1 % KNO3, засевают исследуемую культуру, инкубируют в термостате на протяжении суток. Обязательно ставят контроль с незасеянной средой. В случаеналичия нитратредуктазы при добавлении к засеяному бульйону 3-х капель реактива Касаткина возникает красная окраска. Среда в контрольной пробирке цвет не изменяет.

Для идентификации коринебактерий в последнее время используют бумажные индикаторные диски с глюкозой, сахарозой, мочевиной и крахмалом из набора "Б" для идентификации энтеробактерий (фирма "ИмБио", г. Нижний Новгород). В 4-х пробирках готовят густую взвесь исследуемой культуры и в каждую из них погружают диск с соответствующим углеводом или другим реактивом. После инкубации в термостате учет выделения уреазы проводят через 40-120 мин, а определение сахаролитической активности - через 5-24 час. При наличии уреазы белый диск с мочевиной становится розово-малиновым, при отсутствии - остается белым. Диски с глюкозой и сахарозой при наличии соответствующих ферментов уже через 5-6 час изменяют цвет из красного на желтый. При определении амилазы в пробирку с соответствующим субстратом добавляют индикаторный диск с иодом. Если фермента нет - появляется темно-синяя окраска, если есть - цвет раствора

остается без изменений.

Иммунитет. Наиболее восприимчивыми к дифтерии являются дети в возрасте 1-4 лет. Заболевание оставляет антитоксичес­ кий иммунитет, но не очень прочный - у 6-7 % переболевших возникают повторные заболевания дифтерией.

Невосприимчивость к дифтерии зависит главным образом от содержания антитоксина в крови. Однако антимикробные ан­ титела (опсонины, преципитины, комплементсвязывающие) так­ же имеют значение в становлении иммунитета. Уровень антиток­ сического иммунитета можно установить, определяя в крови ан­ титела в РНГА с эритроцитарным диагностикумом - эритроциты нагружены дифтерийным анатоксином. Титры 1:20 и выше сви­детельствуют об иммунности обследуемого лица. С этой же целью применяется реакция Шика:внутрикожно вводят дифтерийный токсин, который вызывает местную воспалительную реакцию у неиммунных людей, а при наличии антитоксина такая реакция не возникает.

Профилактика и лечение. Основное значение в профилак­ тике дифтерии имеет активная иммунизация, создание антиток­ сического иммунитета. В нашей стране иммунизируют всех детей: начиная с 3-месячного возраста по разработанной схеме вводят вакцину, содержащую как один из компонентов дифтерийный анатоксин (АКДС, АДС).

Другое направление - борьба с дифтерийным носительст вом. Выявленных носителей санируют эритромицином.

Лечение дифтерии должно быть начато как можно раньше - не дожидаясь результатов микробиологического диагноза, вво­ дят антитоксическую противодифтерийную сыворотку. Серотера­пия эффективна в ранний период болезни, пока токсин еще не фиксирован клетками организма и ткани существенно не повреж­ дены. Количество вводимой антитоксической сыворотки, необхо димость повторного введения определяет лечащий врач в зависи­ мости от тяжести инфекции, ее формы и прочих клинических дан­ ных. Создание пассивного антитоксического иммунитета не ис­ ключает и антибактериальную терапию (пенициллин, тетрацик­ лин, эритромицин, сульфамидные препараты).

Палочка коклюша - Bordetella pertussis. Выделена от больного в 1906 г. Бор де и Жангу. Существуют разно-видности возбудителя коклюша - паракоклюшные бактерии (Bact. parapertussis).

Морфология и биологические свойства. Палочки коклюша мелкие, овальные, неподвижные, размером 0,2- 0,3X1 мкм, грамотрицательные, более интенсивно окрашиваются по полюсам. При специальной окраске видна нежная капсула. Хорошо растут на глицериново-картофельном или кровяном агаре при 35-37°С и рН 6,8-7,4. В настоящее время для их. выращивания используют синтетическую казеиново-угольную агаровую среду (КУА). Колонии микробов мелкие, выпуклые, блестящие, прозрачные, окружены небольшой нерезкой зоной гемолиза. На средах без крови растут в форме S- и R-кoлоний. Неактивны в биохимическом отношении. Образуют термостабильный токсин, а также продуцируют гиалуронидазу, плазмокоагулазу, лецитиназу. Наряду с О-антигеном (соматический) у них имеются поверхностные капсульные антигены. Возбудитель коклюша малоустойчив: погибает при действии солнечных лучей в течение часа, при 56°С - через 10-15 мин, быстро гибнет в 3% растворах фенола и лизола.

Патогенез и клиника. Коклюшем обычно болеют дети. Заболевание характеризуется типичными симптомами и цикличностью течения. Возбудители коклюша, проникнув в организм через верхние дыхательные пути, вызывают катаральное воспаление слизистой оболочки трахеи и бронхов. Катаральный период заболевания длится около 2 нед и переходит в конвульсивный (судорожный), сопровождающийся тяжелыми приступами судорожного кашля, возникающего иногда при различных внешних раздражениях (звук, осмотр, инъекции). Основное значение в патогенезе имеет раздражение кашлевого центра. Судорожный период продолжается 4-6 нед и заканчивается с угасанием приступов (период разрешения) выздоровлением. Источником инфекции могут быть больные, а также здоровые бактерионосители, но наиболее опасны больные в катаральном периоде заболевания. Основной путь передачи - воздушно-капельный. Роль предметов в передаче инфекции незначительна ввиду малой устойчивости бактерий коклюша во внешней среде.

Микробиологическая диагностика. Материал берут тампоном со слизистой оболочки носоглотки. Хороший результат дает метод «кашлевых пластинок». Во время кашля ко рту больного вертикально, на расстоянии 5-10 см, подставляют чашку с питательной средой так, чтобы уловить 5-6 кашлевых толчков. Чашку с посевом быстро закрывают крышкой и помещают в термостат при температуре 37°С. Колонии коклюшного микроба вырастают через 2-5 суток, а паракоклюшного через 1-2 сут. Перед посевом поверхность питательной среды обрабатывают пенициллином (7,5 ЕД на чашку) или добавляют его в питательную среду (30 ЕД на 100 мл). Это задерживает размножение сопутствующей микрофлоры. Колонии бордетелл рассматривают с помощью лупы или бинокулярного стереоскопического микроскопа (МБС-1 или МБС-2). При наличии на чашках подозрительных колоний из части их готовят мазок и окрашивают по Граму. При обнаружении грамотрицательных овоидных мелких палочек из остатка колонии ставят реакцию агглютинации на стекле с коклюшной и паракоклюшной сывороткой, разведенной 1:10 (контроль культуры с каплей изотонического раствора хлорида натрия). Агглютинация наступает в течение 5 мин. Для дифференциации коклюшных и паракоклюшных микробов проводят дополнительные исследования. Паракоклюшные бактерии в отличие от коклюшных растут на простом агаре, изменяют цвет казеиново-угольного агара в буро-коричневый, вызывают потемнение кровяного агара и обладают ферментом уреазой. Серологические методы исследования применяют в поздние сроки заболевания. Реакция агглютинации используется для обнаружения антител в сыворотке крови больного с помощью диагностикумов из коклюшных и паракоклюшных микробов. Диагностическим титром антител считают разведение сыворотки 1:20 и выше, учитывая нарастание титра антител в процессе заболевания. РСК при коклюше чувствительна, антигеном служит взвесь живой культуры.

Профилактика и лечение. Общие меры профилактики сводятся к раннему выявлению и изоляции больных. Для специфической профилактики применяют адсорбированную коклюшно-дифтерийно-столбнячную вакцину (АКДС).

Иммунитет. После перенесенного заболевания возникает прочный и длительный иммунитет.

Для лечения используют антибиотики (стрептомицин, левомидетин, тетрациклины), 7-глобулин и витамины. Детям во время лечения необходим свежий воздух.

МИКОБАКТЕРИИ

Род Mycobacterium (сем. Mycobacteriaceae , порядок Actino - mycetales ) включает более 100 видов, ширрко распространенных в природе. Большая часть - сапрофиты и условно-патогенные. У человека вызывают туберкулез (М. tuberculosis - в 92 % слу­чаев, М. bovis - 5 %, М. africanus -в 3%) и лепру (М. 1ер- гае).

Возбудитель туберкулеза - Mycobacterium tuberculosis . Открыт Кохом в 1882 г.

Морфология и биологические свойства. Является типичным представителем рода Mycobacterium и обладает наибольшей кислотоустойчивостью. В мазках из мокроты или органов микобактерии - небольшие тонкие палочки размером 1,5-4x0,4 мкм, грамположительны. На искусственных питательных средах могут образовывать ветвящиеся формы. Микобактерии туберкулеза обладают большой полиморфностью: встречаются палочковидные, зернистые, нитевидные, кокковые, фильтрующиеся и L-формы. Как результат изменчивости появляются кислотоподатливые формы, среди которых часто встречаются так называемые зерна Муха.

Морфологически все виды микобактерий туберкулеза сходны между собой и культивируются на одних и тех же питательных средах. Наилучший метод окраски по Цилю - Нильсену.

Факторы патогенности. Микобактерии туберкулеза содержат эндотоксин. Вирулентные штаммы включают особый липид, который получил название корд-фактора. Вирулентность микробов связана также с наличием фтионовых и миколовых кислот, а также полисахаридно-миколового комплекса. Кох получил из туберкулезных бактерий ядовитое вещество белковой природы - туберкулин, патогенное действие которого проявляется только в зараженном организме. Туберкулин обладает свойствами аллергена и в настоящее время его используют при постановке аллергических проб, позволяющих определить инфицированность человека или животных микобактериями. Существует несколько препаратов туберкулина. «Старый» туберкулин Коха (альт-туберкулин) представляет собой фильтрат убитой нагреванием 5-6-недельной культуры микробактерий, выращенной на глицериновом бульоне. «Новый» туберкулин Коха - высушенные микобактерии туберкулеза, размельченные в 5% глицерине до гомогенной массы. Получают туберкулин из микобактерий бычьего вида. Существуют также очищенные от балластных веществ препараты туберкулина (PPD, РТ).

Устойчивость. Микобактерии туберкулеза долго сохраняют жизнеспособность вне организма человека или животного. В высохшей мокроте они живут до 10 мес. Выдерживают температуру 70°С в течение 20 мин, а кипячение - 5 мин; в 5% растворе карболовой кислоты и растворе сулемы 1: 1000 погибают через сутки, в 2% растворе лизола - через час. Из дезинфицирующих средств наиболее чувствительны к хлорной извести и хлорамину.

Патогенность. Туберкулез широко распространен среди крупного скота, кур; реже болеют мелкий скот и свиньи. Из экспериментальных животных наиболее чувствительны к человеческому типу микобактерий туберкулеза морские свинки, кролики, к бычьему - кролики, морские свинки, к птичьему типу - птицы и белые мыши. Эти свойства микобактерий используют для дифференциации различных их типов.

Патогенез и клиника. Заражение происходит чаще всего воздушно-капельным путем. Инкубационный период при туберкулезе длится 15-30 дней. В случае проникновения микобактерий туберкулеза в организм человека или животного происходит образование туберкулезных бугорков в пораженных тканях. Они представляют собой скопление лейкоцитов и гигантских клеток, в центре которых находятся микобактерии. При хорошей сопротивляемости организма плотная соединительная ткань окружает бугорок и микобактерии не выходят за его пределы, оставаясь жизнеспособными многие годы. У лиц с пониженной устойчивостью к инфекции или при ослаблении иммунного состояния под влиянием неблагоприятных воздействий микобактерии туберкулеза начинают размножаться в первичном очаге, в результате чего туберкулезный бугорок подвергается творожистому некрозу. В процесс иногда быстро вовлекаются значительные части легкого или другого органа.

Различают легочную и внелегочные клинические формы туберкулеза, при которых поражаются кости, суставы, кожа, почки гортань, кишечник и другие органы.
Обычно наблюдаются периоды улучшения и ухудшения; конечный результат определяется состоянием макроорганизма. Заболевание может развиваться остро, но чаще протекает хронически, многие годы. Отмечаются слабость, ночные поты, утомляемость, потеря аппетита, небольшие подъемы температуры вечером, кашель. При рентгеноскопии легких обнаруживаются затемнения различной степени: очаговые или диффузные.

Иммунитет. Большинство людей достаточно устойчивы к туберкулезной инфекции, и заражение их в детстве ведет обычно к образованию первичных туберкулезных очагов, подвергающихся обызвествлению (очаги Гона). Приобретенный иммунитет носит характер нестерильного, т. е. сохраняется до тех пор, пока в организме имеется возбудитель.

Микробиологическая диагностика. Включает микроскопический, микробиологический, биологический и серологический методы. Микроскопия - наиболее распространенный метод. Он прост, доступен, позволяет быстро получить ответ. При микроскопии мокроты выбирают гнойные плотные частички, тщательно растирают их тонким слоем между двумя предметными стеклами. Сушат на воздухе, фиксируют пламенем и окрашивают по Цилю - Нильсену. Микобактерии туберкулеза - тонкие, слегка изогнутые палочки, окрашенные в ярко-красный цвет; остальной фон препарата голубой. Недостатком метода является его небольшая чувствительность. Увеличения чувствительности микроскопии при диагностике туберкулеза достигают использованием методов обогащения. Одним из них является гомогенизация материала путем воздействия на него различными веществами, растворяющими

Более эффективен метод флотации (всплывание), основанный на том, что после длительного встряхивания гомогенизированного едким натром исследуемого материала с дистиллированной водой и ксилолом (или бензолом) образуется слой пены, всплывающий наверх и захватывающий микобактерии туберкулеза. Слой пены снимают и наслаивают на теплое предметное стекло несколько раз по мере высыхания. Это увеличивает возможность обнаружения микобактерий туберкулеза.

Люминесцентная микроскопия более чувствительна, чем обычная. Препарат готовят, как обычно, фиксируют смесью Никифорова и окрашивают аурамином в разведении 1: 1000. Затем препарат обесцвечивают солянокислым спиртом и докрашивают кислым фуксином, который «гасит» свечение находящихся в препаратах лейкоцитов, слизи и тканевых элементов, создавая контраст между темным фоном и светящимися ярким золотисто-зеленым светом микобактериями туберкулеза. Препарат микроскопируют в люминесцентном микроскопе. Недостаток микроскопии - возможность ошибок при наличии кислотоупорных сапрофитов.

При отрицательном результате микроскопического исследования используют микробиологические и биологические методы. Исследуемый материал предварительно обрабатывают 6% раствором серной кислоты для уничтожения посторонней микрофлоры.

Микробиологический метод позволяет выявить в исследуемом материале 20-100 микобактерий. От микобактерий туберкулеза дифференцируют по культуральным признакам кислотоупорные сапрофиты (рост сапрофитов возможен при комнатной температуре в течение нескольких дней). Недостатком метода является медленный рост микобактерий туберкулеза на питательных средах (посевы выдерживают в термостате 2- З мес).

Разработаны ускоренные методы выделения культур микобактерий туберкулеза - Прайса и Школьниковой. Сущность этих методов заключается в том, что исследуемый материал наносят на предметное стекло, обрабатывают серной кислотой, промывают изотоническим раствором хлорида натрия и помещают в питательную среду с цитратной кровью. Через 5-7 дней стекло вынимают и опрашивают по Цилю - Нильсену. Микроскопируют при малом увеличении. Микроколонии вирулентных штаммов микобактерий имеют вид жгутов, кос.

При использовании биологического метода обработанный патологический материал вводят в паховую область морским свинкам. Даже при наличии единичных туберкулезных микобактерий животное заболевает: через 6-10 дней регионарные лимфатические узлы увеличиваются, в них обнаруживают большое количество микобактерий туберкулеза. Через 3-6 нед животное погибает от генерализованной туберкулезной инфекции.

Для определения инфицированности организма микобактериями используют аллергический метод. Применяют внутрикожную пробу с туберкулином (реакция Манту) и накожную пробу Пирке. У инфицированных микобактериями на месте введения туберкулина образуются покраснение и припухлость.

Профилактика и лечение. Профилактика основана на своевременном выявлении больных туберкулезом, диспансеризации их, обезвреживании молока и мяса больных животных и птиц. Большое значение имеет также активная иммунизация людей, которая способствует уменьшению заболеваемости, облегчению тяжести течения туберкулезного процесса и снижению летальности. Используют живую вакцину БЦЖ, полученную французскими учеными Кальметтом и Гереном (лат. BCG-Ваcilla Calmette - Guerin) при культивировании туберкулезных микобактерий бычьего типа на глицериновом картофеле с желчью в течение 13 лет. Эту вакцину вводят новорожденным однократно внутрикожно на наружную поверхность левого плеча. Ревакцинацию проводят через 7-12 лет и в дальнейшем 4 раза через 3-6 лет. Иммунитет развивается через 3-4 нед и сохраняется 1 - 17,2 года.

Лечение проводят различными антибиотиками и химиопрепаратами (стрептомицин, ПАСК, ИНХА-17, ларусан, пассомин, тубазид, фтивазид и др.). Разрабатывают и применяют антибиотики резерва: циклосерин, этоксид, тибон, виомицпн, каиамицин и др. В ряде случаев показано хирургическое и курортное лечение.

Микобактери и туберкулеза

М. tuberculosis - основной возбудитель туберкулеза у челове­ка - был открыт в 1882 г. Р. Кохом.

Туберкулез - хроническое инфекционное заболевание. В за­висимости от локализации патологического процесса выделяют туберкулез органов дыхания и внелегочные формы (туберкулез кожи, костей и суставов, почек и др.). Локализация процесса в определенной степени зависит от путей проникновения мико­ бактерий в организм человека и вида возбудителя.

Морфология, физиология. Микобактерий туберкулеза - грам- положительные прямые или слегка изогнутые палочки 1-4Х X 0,3-0,4 мкм (рис. 20.8). Высокое содержание липидов придает клеткам микобактерий туберкулеза ряд характерных свойств: устойчивость к кислотам, щелочам и спирту, трудное восприятие анилиновых красителей (для окраски туберкулезных палочек применяют метод Циля - Нильсена). В культурах встречаются зернистые формы, ветвящиеся, зерна Муха - шаровидные кисло- топодатливые, легко окрашивающиеся по Граму. Возможен пере­ ход в фильтрующиеся и L -формы. Неподвижны, спор и капсул не образуют.

Для размножения микобактерий туберкулеза в лабораторных условиях используют сложные питательные среды, содержащие яйца, глицерин, картофель, витамины. Стимулируют рост мико­ бактерий аспарагиновая кислота, соли аммония, альбумин, глю­коза, твин-80. Чаще всего применяют среду Левенштейна - Йен- сена (яичная среда с добавлением картофельной муки, глице­ рина и соли) и синтетическую среду Сотона (содержит аспара гин, глицерин, цитрат железа, фосфат калия). Размножаются микобактерий туберкулеза медленно. Велик период генерации - деление клеток в оптимальных условиях происходит 1 раз в 14- 15 ч, тогда как большинство бактерий других родов делятся че­ рез 20-30 мин. Первые признаки роста можно обнаружить через 8-10 дней после посева. Затем на плотных средах появляются морщинистые, сухие с неров­ными краями колонии. В жид­ких средах сначала образуется нежная пленка на поверхности, которая утолщается и падает на дно. Среда при этом остает­ся прозрачной.

Микобактерий туберкулеза в мокроте больного.

Антигены. Клетки микобактерий содержат соединения, бел­ ковые, полисахаридные и липидные компоненты которых обуслов­ ливают антигенные свойства. Антитела образуются на туберку­ линовые протеиды, а также на полисахариды, фосфатиды, корд-фактор. Специфичность антител к полисахаридам, фосфатидам определяется в РСК, РНГА, преципитации в геле. Антигенный состав М. tuberculosis , M . bovis , M . leprae и других микобак­ терий (включая многие сапрофитические виды) сходен. Туберку­ линовый протеин (туберкулин) обладает выраженными аллерген­ными свойствами.

Экология и распространение. В естественных условиях М. tuberculosis вызывает туберкулез у человека, человекооб­ разных обезьян. Из лабораторных животных высокочувствитель­ ными являются морские свинки, менее - кролики. К М. bovis - возбудителю туберкулеза у рогатого скота, свиней и человека - высокочувствительны кролики и менее - морские свинки. М. africanus вызывает туберкулез у людей в странах тропи­ ческой Африки. Наиболее распространен воздушно-капельный путь заражения, при котором возбудитель проникает в организм через верхние дыхательные пути, иногда через слизистые обо­ лочки пищеварительного тракта или через поврежденную кожу.

Попадая в окружающую среду, микобактерий туберкулеза длительное время сохраняют свою жизнеспособность. Так, в вы­ сохшей мокроте микроорганизмы выживают в течение нескольких недель, на предметах, окружающих больного (белье, книги) - более 3 мес, в воде - более года; в почве - до 6 мес. Дли­ тельно сохраняются эти микроорганизмы в молочных продуктах.

ЛЕКЦИЯ 7

Теоретическое занятие. Коринебактерии дифтерии. Морфология, токсинообразование. Особенности устойчивости в окружающей среде. Патогенез дифтерии. Иммунитет. Специфическая профилактика и терапия. Методы диагностики.

Микобактерии туберкулеза. Морфология, токсинообразование. Особенности устойчивости в окружающей среде. Заболевания, вызываемые микобактериями туберкулеза. Иммунитет. Методы диагностики. Аллергическая проба Манту. Специфическая профилактика туберкулеза.

Возбудители особо опасных инфекций (ООИ). Общая характеристика свойств возбудителей ООИ. Меры безопасности при отборе материала.

КОРИНЕБАКТЕРИИ ДИФТЕРИИ И МИКОБАКТЕРИИ ТУБЕРКУЛЁЗА

Коринебактерии дифтерии.

Возбудитель дифтерии относится к отделу Firmicutes, типу Actinobacteria, классу Actinobacteria, порядоку Actinomycetales, семейству Corinebacteriaceae, роду Corinebacterium, виду C. diphtheriae

Возбудителя открыл - Т.К.Клебс (1883), выделил - Ф.Леффлер (1884)

Морфология и культивирование. C. Diphtheria грамположительные, тонкие слегка изогнутые палочки (полиморфны – ветвистые, нитевидные, кокковидные), размером – 1-8 × 0,3-0,8 мкм. Располагаются в мазках под углом в виде римских цифр Х и V или растопыренных пальцев руки. Образуют включения – зерна волютина (окрашиваются по Нейссеру в сине-фиолетовый цвет, а сам возбудитель в жёлтый). Не имеют спор, капсул, жгутиков, имеют фимбрии.

Факультативные анаэробы или аэробы, хемоорганогетеротрофы. Растут при 37 0 С (15 0 С-40 0 С), рН среды – 7,2-7,6. Селективные среды – среда Тинсдаля (цистин-теллурит-сывороточный агар), среда Клауберга (МПА с добавлением гемолизированной крови, теллурита калия. глицерина), среда Бучина (МПА с добавлением хинозола, цистина, рыбьего гидролизата. крови, водно-розового)

На сывороточном, кровяном агаре образуют крошковидные колонии кремового цвета (булыжная мостовая); на среде Тинсдаля – колонии коричневого цвета; на среда Бучина – колонии голубоватого цвета; а на среде Клауберга образуют колонии трёх типов:

– gravis – крупные шероховатые (R-форма) розеткообразные черные или серые колонии;

– mitis – темные гладкие (S-форма) блестящие;

– intermedius – мелкие черные (RS-форма)

Рост на бульоне характеризуется равномерном помутнением или поверхностной пленкой, которая растет крошится и хлопьями оседает на дно пробирки;

gravis образуетповерхностную пленку и зернистый осадок;

mitis – диффузное помутнение;

intermedius – муть и зернистый осадок

Ферментативные свойства. Коринебактерии дифтерии образуют: сахаролитические ферменты – сбраживают глюкозу; расщепляют крахмал; протеолитические ферменты - образуют цистиназу; восстанавливают нитраты; не выделяют уреазу, не разжижают желатин; не образуют индол; образуют сероводород

Факторы патогенности. Возбудитель образует следующие факторы патогенности:

· гемолизирующий фактор приводит к развитию геморрагического синдрома;

· фимбрии (ворсинки или пили) обеспечивают адгезию и колонизацию;

· корд-фактор нарушает процессы дыхания в различных клетках организма;

· некротический фактор, фибринолизин;

· экзотоксин (гистотоксин, дермотоксин, геморлизин) – ведущий фактор патогенности.

Экзотоксин состоит из фракций А и В. Фракция А (токсический полипептид – собственно токсин) обладает некротическими свойствами. Блокирует белковый синтез в клетках, в том числе в миокарде и клетках нервной системы (демиелинизация нервных волокон – вызывает параличи, парезы). Повреждает эпителиоциты стенок сосудов, вызывая усиление экссудации.

Фракция В(транспортный полипептид) – способствует распространению фракции А, так как обладает гиалуронидазой, нейраминидазой, протеазной активностью.

Экзотоксин неустойчив, легко разрушается под действием температуры, света, кислорода воздуха. Под действием формалина (температура 38-40 0 С, 3-4 недели) превращается в анатоксин.

Антигены: К-антиген – типоспецифический, термолабильный, белковой природы; О-антиген – группоспецифический, термостабильный липополисахарид.

В реакции агглютинации выделяют 54 серотипа. Имеют 19 фаговаров.

Резистентность (устойчивость во внешней среде). Чувствительны к высокой температуре, перекиси водорода, раствору сулемы, карболовой кислоты, антибиотикам. При действии 1% раствора фенола и 60 0 С погибают в течение 10 минут. На свёрнутой сыворотке остаются живыми до года. Выделяясь во внешнюю среду со слюной, пленками, дифтерийные палочки способны сохранять жизнеспособность при комнатной температуре до двух месяцев, на детских игрушках – до нескольких суток.

Патогенность для животных. В естественных условиях патогенные коринебактерии обнаружены у лошадей, коров, собак, инфицированных вероятно от больных людей. Но они не служат источником инфекции.

Из лабораторных животных восприимчивы морские свинки и кролики. При их заражении развивается типичная картина интоксикации с образованием на месте введения воспаления, отёка, некроза. Внутренние органы гиперемированы, в надпочечниках наблюдаются кровоизлияния.

Дифтерия – острое инфекционное заболевание, характеризующееся образованием фиброзных пленок у входных ворот и интоксикацией приводящей к токсическим поражениям нервной и сердечно-сосудистой системы, а также других систем и органов.

Источник инфекции: больной человек и бактерионоситель.

Пути передачи инфекции: воздушно-капельный, контактно-бытовой (мягкие игрушки у детей).

Входные ворота: слизистые оболочки носоглотки, реже конъюнктивы глаз, раневая поверхность.

Патогенез заболевания. Попадая на слизистые оболочки, возбудитель активно размножается на месте входных ворот и выделяет экзотоксин. Токсин распространяется лимфогенным и гематогенным путём, что приводит к развитию интоксикации, сопровождающейся поражением паренхиматозных органов, миокарда, почек, надпочечников, нервной ткани. У входных ворот за счёт выделения экзотоксина подавляется фагоцитоз, повреждаются эндотелиоциты, увеличивается проницаемость сосудистой стенки, усиливается экссудация. В экссудате обнаруживается фибриноген, при свёртывании которого образуются серовато- белого цвета плёнчатые налёты, плотно спаянные с окружающей тканью. Развивается фиброзное воспаление. Плёнки тяжело снимаются, при их отрыве обнажается эрозийная поверхность. Некроз захватывает все слои слизистой оболочки, на ней появляются язвы (дифтерическое воспаление).

Клиническая картина. Существуют разные по локализации формы дифтерии: дифтерия зева, носа, гортани, глаз, наружных половых органов, кожи, ран и другие. В 80-95% случаев наблюдается дифтерия зева.

Инкубационный период – от 2 до 10 дней. Заболевание начинается с повышения температуры тела, появления боли при глотании, плёнки на миндалинах, увеличения лимфатических узлов. У взрослых дифтерия может протекать как лакунарная ангина. У детей раннего возраста одновременно с зевом и носом в патологический процесс вовлекается гортань, и в результате отека гортани и голосовых связок развивается дифтерийный круп, который может привести к асфиксии и смерти.

При токсической форме дифтерии начало острое, температура 39-40 0 С, резко выражена интоксикация; налёты толстые бугристые, гнойные, плохо снимаются; миндалины при снятии налётов кровоточат; развивается отек тканей, региональные лимфоузлы увеличены, болезненны.

Осложнения – токсический миокардит, острая недостаточность гипофизарно-надпочечниковой системы, паралич дыхательных мышц.

Иммунитет. До 5 месяцев существует естественный пассивный иммунитет новорожденного, приобретенный ребенком во время внутриутробного развития. После перенесённого заболевания формируется стойкий стерильный антитоксический и антимикробный иммунитет. Этот естественный активный иммунитет связан с фагоцитарной активностью клеток, опсонинами, агглютининами, комплементсвязывающими веществами.

Искусственный активный (поствакцинальный) иммунитет достаточно продолжительный – до 3-5 лет.

Профилактика. Ранняя диагностика, немедленная госпитализация, изоляция и лечение больных; выявление и санация носителей антибиотиками; полноценная дезинфекция в очаге; карантин в детских учреждениях.

Специфическая профилактика:

1. Активная. Используются вакцины: АД (дифтерийный анатоксин), АДС (адсорбированный дифтерийно-столбнячный анатоксин), АДСМ, АКДС (адсорбированной коклюшно-дифтерийно-столбнячной вакцины). Вакцинация АКДС проводится трехкратно детям в возрасте 3 месяцев (до этого времени у них сохраняется плацентарный иммунитет). Ревакцинацию проводят с помощью АДС-анатоксина не только в детском возрасте, но и взрослым людям каждые 10 лет.

При контакте с больным человеком людям, не имеющим напряженного антитоксического иммунитета, вводят дифтерийный анатоксин (АД).

2. Пассивная. Проводится в очагах заболевания антитоксической сывороткой, доза которой определяется формой и тяжестью заболевания.

Лечение. Применение в ранние сроки антитоксической противодифтерийной сыворотки, которую вводят по методу Безредки (дробно, постепенно увеличивают дозу). Параллельно используют антибиотики (пенициллин, тетрациклины, эритромицин), сульфаниламидные препараты, глюкозу, витамины, антигистаминные препараты.

Род Corynebacterium .

Возбудитель дифтерии - Corynebacterium diphtheriae и большая группа близких по морфологическим и биохимическим свойствам микроорганизмов рода коринебактерий называют коринеформными бактериями или дифтероидами. Они представлены грамположительными неподвижными палочками, чаще с утолщениями на концах, напоминающими булаву (coryne - булава). Дифтероиды широко распространены в почве, воздухе, пищевых продуктах (молоке). Среди них можно выделить три экологические группы:

Патогены человека и животных;

Патогены растений;

Непатогенные коринебактерии.

Многие виды дифтероидов являются нормальными обитателями кожи, слизистых зева, носоглотки, глаз, дыхательных путей, уретры и половых органов.

Дифтерия .

Дифтерия - острое инфекционное заболевание преимущественно детского возраста, которое характеризуется интоксикацией организма дифтерийным токсином и характерным фибринозным (дифтеритическим) воспалением в месте локализации возбудителя (phther - пленка).

Морфологические и тинкториальные свойства. C.diphtheriae - тонкие полиморфные палочки с булавовидными концами, часто содержащие волютиновые включения, выявляемые окраской метиленовым синим или по Нейссеру. При последнем палочки окрашены в желто - соломенный цвет, зерна волютина (полиметафосфата) - в темно - коричневый цвет. В культурах палочки находятся под углом друг к другу (особенности деления) , образуя различные фигуры - растопыренных пальцев, V, Y, L и т.д. Имеют микрокапсулу, а также фимбрии, облегчающие адгезию к эпителию слизистых оболочек.

Культуральные свойства. На простых средах коренебактерии дифтерии не растут. Они требуют сред с кровью или сывороткой крови (среды Леффлера, Ру), на которых рост отмечается уже через 10-12 часов, за это время сопутствующая (контаминирующая пробы) микрофлора полностью развиться не успевает.

Наиболее оптимальны теллуритовая среда и теллурит - шоколадный агар Маклеода. Высокие концентрации теллурита калия в этих средах подавляют рост посторонней флоры. Коринебактерии дифтерии восстанавливают теллурит до металлического теллура, что придает их колониям темно - серый или черный цвет.

У этого возбудителя выделяют биотипы - gravis, mitis, intermedius, отличающиеся по морфологии, антигенным и биохимическим свойствам, тяжести заболеваний у человека. Тип gravis чаще вызывает вспышки и более тяжелое течение, для него характерны крупные с неровными краями и радиальной исчерченностью колонии в виде маргаритки (R- формы). Тип mitis вызывает преимущественно легкие спорадические заболевания, образует на плотных средах мелкие гладкие колонии с ровными краями (S- формы). Тип intermedius занимает промежуточное положение, образует на плотных средах переходные по характеристикам RS- формы, однако еще более мелкие. На жидких средах вызывают помутнение сред, образуют крошковидный осадок.

Биохимические свойства. Коринебактерии дифтерии ферментируют глюкозу, мальтозу. Отсутствие активности в отношении сахарозы и мочевины - важный дифференциальный признак среди дифтероидов. Обладают цистеназной активностью (расщепляют цистеин) - проба Пизу.

Антигенная структура. Выделяют О- и К- антигены. Полисахаридные компоненты О- антигенов клеточной стенки обладают межродовыми свойствами, обусловливая неспецифические перекрестные реакции с микобактериями, актиномицетами (нокардиями).

Поверхностные К- антигены - капсульные белки, обладают видовой специфичностью и иммуногенностью. Выделяют 11 серотипов. Серотипы 1-5 и 7 относятся к биовару gravis. Серотипирование культур проводят в РА с диагностическими сыворотками к соответствующим сероварам и полигрупповой агглютинирующей сывороткой.

В серологической диагностике у людей чаще применяют РПГА, более чувствительную, чем РА. В настоящее время применяют также ИФА. Многие штаммы коринебактерий дифтерии (особенно нетоксигенные) обладают спонтанной агглютинабельностью и полиагглютинабельностью.

Факторы патогенности. Токсигенные штаммы возбудителя дифтерии продуцируют сильный экзотоксин (термолабильный высокотоксичный иммуногенный белок). Нетоксигенные штаммы не вызывают заболевания.

Токсин вызывает необратимое блокирование удлинения полипептидной цепи, т.е. любого белкового синтеза. Поражаются в основном определенные системы: симпатико - адреналовая, сердце и кровеносные сосуды, периферические нервы. Отмечаются структурные и функциональные нарушения миокарда, демиелинизация нервных волокон, приводящая к параличам и парезам.

Способность к токсинообразованию проявляют лишь лизогенные штаммы, инфицированные бактериофагом (бета - фагом), несущим ген tox, который кодирует структуру токсина (т.е. несущие гены умеренного профага в своей хромосоме). Фаготипирование применяют для дифференциации штаммов коринебактерий дифтерии.

Эпидемиология. Резервуар - человек (больной, реконвалесцент, бактерионоситель). Основной путь передачи - воздушно - капельный, сезонность - осенне - зимняя. Возбудитель хорошо сохраняется при низких температурах, высушенном состоянии (слюна, слизь, пыль).

Клинико - патогенетические особенности. Возбудитель в месте внедрения вызывает фибринозное воспаление с образованием плотно спаянной с тканями фибринозной пленки. Существенное значение в вызываемой патологии имеет действие экзотоксина (описано в разделе “факторы патогенности”). По локализации выделяют дифтерию ротоглотки (наиболее часто), дыхательных путей, носа и редкой локализации (глаза, наружные половые органы, кожа, раневая поверхность). Дифтерия зева может быть причиной крупа и асфиксии.

Лабораторная диагностика. Основной метод диагностики - бактериологический. Применяют для выявления больных, бактерионосителей, контактных. Стерильными тампонами берут материал для микроскопии и посевов - слизь из зева и носа, пленки с миндалин и других мест, подозрительных на наличие дифтеритических поражений.

Возбудитель выделяют посевом на элективные теллуритовые среды и кровяной агар. На слизистой оболочке глаза часто выявляют C.xerosis (возможная причина хронических конъюнктивитов), в носоглотке - C.pseudodiphtheriticum (палочка Хофманна), выявляют и другие дифтероиды.

Для дифференциации возбудителя дифтерии от дифтероидов используют такие показатели, как способность восстанавливать теллурит и образовывать темные колонии, пробу Пизу, ферментацию углеводов (глюкоза, мальтоза, сахароза) и мочевины, способность расти в анаэробных условиях (характерно для возбудителя дифтерии).

Обязательным этапом является определение токсигенности культуры. Наиболее распространенные методы - биопробы на морских свинках, реакция преципитации в агаре. Используют также ИФА с антитоксином, генетические зонды и ПЦР для выявления фрагмента А гена tox.

Лечение. Используют антитоксическую противодифтерийную сыворотку, антибиотики и сульфаниламидные препараты.

Постинфекционный иммунитет - стойкий, преимущественно антитоксический. Для количественного определения уровня антитоксического иммунитета ранее применялась проба Шика (внутрикожное введение токсина), сейчас - РПГА с эритроцитарным диагностикумом, получаемым сенсибилизацией эритроцитов дифтерийным анатоксином.

Профилактика. В основе - массовая иммунизация населения. Используют различные препараты, содержащие дифтерийный анатоксин - АКДС, АДС, АДС- М, АД и АД- М.

Род Bordetella . коклюш

Бордетеллы - мелкие коккобациллы, имеют форму овоидной палочки, грамотрицательны, неустойчивы во внешней среде. Основное значение имеют три вида.

1. B.pertussis - возбудитель коклюша - острого инфекционного заболевания, сопровождающегося воспалением гортани, трахеи и бронхов и приступообразным кашлем.

2. B.parapertussis - возбудитель паракоклюша.

3. B.bronchiseptica - возбудитель коклюшеподобного заболевания собак, кошек и кроликов, может вызывать у людей респираторные заболевания по типу ОРВИ (относительно редко).

Культуральные особенности. Бордетеллы требовательны к средам, особенно возбудитель коклюша. Для первичной изоляции этих гемофильных микроорганизмов используют картофельно - глицериновый агар с добавлением крови (среду Борде - Жангу) или казеиново - угольный агар (КУА). На кровяных средах возбудитель коклюша вызывает образование мелких колоний металлического оттенка с потемнением сред, на КУА - буровато - коричневое окрашивание колоний. Основные формы колоний - гладкие (S) - так называемая Iфаза (вирулентные культуры) через промежуточные формы переходят в шероховатые (R) - фаза IV, что сопровождается изменением культуральных, биохимических и антигенных свойств, потерей вирулентности.

Антигенный состав. Имеются общие (родовые) и специфические (видовые) антигены. Видоспецифическими являются соматические О- антигены (агглютиногены), выявляемые в РА.

Факторы патогенности. Главный фактор - термолабильный экзотоксин белковой природы, обладающий тропизмом к нервной и сосудистой системе. Имеется термостабильный эндотоксин , обладающий токсическими и сенсибилизирующими свойствами. Трахеальный цитотоксин вызывает повреждение мерцательного эпителия. Бактерии продуцируют гиалуронидазу, лецитиназу, плазмокоагулазу.

Эпидемиология. Источник инфекции при коклюше и паракоклюше - больные типичными и стертыми формами инфекции. Механизм заражения - воздушно - капельный. Возбудитель, попавший на слизистую оболочку дыхательных путей, размножается, выделяет экзо- и эндотоксины, некротизирует слизистую, раздражают кашлевые рецепторы и кашлевой центр продолговатого мозга, вызывает спазматические приступы кашля.

Лабораторная диагностика. Посев проводят методом “кашлевых пластинок” или материал берут заднеглоточным тампоном с посевом на агар Борде - Жангу и КУА. Идентификация выделенных культур проводится по морфологическим и культуральным свойствам, а также в РА со специфическими сыворотками. Для экспресс - диагностики и идентификации применяют метод флюоресцирующих антител.

Для серологической диагностики используют различные методы - РА, РСК, РПГА с исследованием парных сывороток, взятых в динамике инфекционного процесса.

Лечение. В основе лечения - антибактериальная терапия антибиотиками (гентамицин, ампициллин и др.).

Иммунитет и иммунопрофилактика. Постинфекционный иммунитет стойкий, видоспецифический, обусловлен гуморальными и клеточными факторами.

Для вакцинации используют убитые бордетеллы I фазы. В вакцине АКДС имеется коклюшный компонент (20 млрд микробных тел/ мл).

Вопрос 7. Сложные методы окраски препаратов Окраска по Граму

Вопрос 8. Строение бактериальной клетки

Тема 2: Морфология актиномицетов, грибов, спирохет, вирусов и простейших.

Вопрос 2. Классификация и морфология спирохет: боррелии, трепонемы и лептоспиры. Классификация спирохет

Морфология спирохет

Вопрос 3. Классификация и строение риккетсий.

Вопрос 4. Классификация и строение хламидий.

Вопрос 5. Классификация и строение микоплазм.

Вопрос 6. Классификация грибов, их строение. Методы изучения. Классификация грибов

Ультраструктура грибов

Вопрос 7. Морфология вирусов

Вопрос 8. Классификация и строение простейших. Классификация простейших:

Ультраструктура простейших

Тема 3: Физиология микроорганизмов. Выделение чистых культур аэробных бактерий.

Вопрос 1. Питание бактерий

Вопрос 2. Питательные среды, их классификация.

Вопрос 3. Понятие о стерилизации, методы стерилизации.

Вопрос 4. Дыхание бактерий.

Вопрос 5. Ферменты микробов, их классификация

Вопрос 6. Принципы культивирования и идентификации бактерий:

Вопрос 7. Рост и размножение микроорганизмов на жидких и плотных питательных средах. Деление. Фазы развития бактериальной популяции. Рост и размножение бактерий

Виды роста бактерий на жидких и плотных питательных средах

Фаза развития бактериальной популяции

Вопрос 8. Этапы бактериологического исследования:

Вопрос 9. Методы выделения чистых культур аэробов:

Вопрос 10. Культивирование вирусов

Вопрос 11. Бактериофаги

Тема 4: Экология микроорганизмов

Теоретический материал для самоподготовки

Вопрос 1. Микрофлора почвы и методы ее изучения.

Вопрос 2. Микрофлора воды и методы ее изучения.

Вопрос 3. Микрофлора воздуха и методы ее изучения.

Вопрос 4. Естественная микрофлора тела человека, ее значение.

Состав нормальной микрофлоры

Вопрос 5. Эубиоз и дисбиоз.

Вопрос 6. Эубиотики.

Тема 5: Генетика микроорганизмов.

Вопрос 1. Организация генетического материала у бактерий.

Вопрос 2. Внехромосомные факторы наследственности: плазмиды, транспозоны, is-последовательности.

Вопрос 3. Модификации. R-s-диссоциации. Мутации. Мутагены. Репарации.

Вопрос 4. Генетические рекомбинации: конъюгация, трансформация, трансдукция.

Тема 6: Учение об инфекции. Химиотерапевтические препараты. Антибиотики.

Вопрос 1. Инфекция. Условия возникновения и пути передачи возбудителя

Условия возникновения

Пути передачи:

Вопрос 2. Формы инфекции и их характеристика.

Вопрос 3. Периоды инфекционной болезни.

Вопрос 4. Характеристика бактериальных токсинов.

Вопрос 5. Антибиотики: классификация, применение, осложнения при приеме антибиотиков.

Вопрос 4. Методы определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам.

Вопрос 5. Важнейшие группы химиотерапевтических препаратов и механизмы их действия.

Тема 7: Иммунитет. Виды иммунитета.

Вопрос 1. Понятие об иммунитете. Виды и формы иммунитета.

Вопрос 2. Антигены. Основные свойства и строение антигенов.

Вопрос 3. Антигены микроорганизмов.

Вопрос 4. Антитела (иммуноглобулины).

Вопрос 5. Структура иммуноглобулинов. Свойства иммуноглобулинов.

Вопрос 6. Классы и типы иммуноглобулинов.

Тема 8: Реакции иммунитета, их практическое значение. Реакции агглютинации, преципитации, их виды и применение; реакции гемолиза и связывания комплемента. Иммунобиологические препараты.

Вопрос 1 . Реакция агглютинации и ее варианты

Вопрос 2. Реакция преципитации и ее виды.

Вопрос 3. Реакция гемолиза.

Вопрос 4. Реакция связывания комплемента.

Вопрос 5. Вакцины: классификация, применение.

Вопрос 6. Сыворотки и иммуноглобулины.

Часть 2. Частная микробиология, вирусология

Тема1: Микробиологическая диагностика бактериальных инфекций верхних дыхательных путей.

Материал для теоретической подготовки

Вопрос 1. Стафилококки (род Staphylococcus)

Вопрос 2. Стрептококки (род Streptococcus)

Тема 2: Микробиологиче­ская диагностика туберкулеза, дифтерии и коклюша.

Теоретический материал для самоподготовки

Вопрос 1. Микобактерии туберкулеза

Вопрос 2. Коринебактерии дифтерии Сorynebacterium diphtheriae (род Corynebacterium)

Вопрос 3. Bordetella pertussis - возбудитель коклюша

Тема 3: Микробиологическая диагностика раневых инфекций.

Теоретический материал для самоподготовки

Вопрос 1. Возбудитель столбняка - Clostridium tetani

Вопрос 2. Возбудители газовой гангрены – бактерии рода Clostridium Виды клостридий, вызывающие инфекцию: c.Perfringens, c. Novyi, c.Histolyticum, c.Septicum.

Тема 4: Микробиологическая диагностика инфекций, передающихся половым путем.

Теоретический материал для самоподготовки Вопрос 1.Neisseria gonorrhoeae (гонококки)

Вопрос 4. Возбудитель урогенитального хламидиоза – Chlamydia trachomatis

Тема 5: Микробиологическая диагностика бактериальных кишечных инфекций.

Теоретический материал для самоподготовки

Вопрос 1. Эшерихии (род Escherichia)

Вопрос 2. Сальмонеллы – род salmonella

Вопрос 3. Патогенез сальмонеллезов.

Вопрос 4. Возбудители дизентерии - шигеллы (род Shigella)

Вопрос 5. Возбудитель холеры – холерный вибрион (Vibrio cholerae)

Вопрос 6. Возбудители ботулизма (Clostridium botulinum)

Тема 6: Микробиологическая диагностика зоонозных инфекций.

Теоретический материал для самоподготовки

Вопрос 1. Бруцеллы (род Brucella) – возбудители бруцеллеза

Вопрос 3. Yersinia pestis – возбудитель чумы

Вопрос 4. Франциселлы (Francisella tularensis) – возбудители туляремии

Тема 7: Микробиологическая диагностика респираторных вирусных инфекций.

Теоретический материал для самоподготовки

Вопрос 1.Ортомиксовирусы (семейство Orthomyxoviridae) – вирус гриппа

Вопрос 2. Вирус кори (семейство Paramyxoviridae, род Morbillivirus)

Вопрос 3. Вирус краснухи (сем. Togaviridae)

Тема 8. Микробиологическая диагностика кишечных вирусных инфекций.

Теоретический материал для самоподготовки

Вопрос 1.Вирусы полиомиелита 1, 2, 3

Вопрос 2. Вирус гепатита а

Вирус гепатита е человека (семейство Caliciviridae)

Тема 9. Микробиологическая диагностика вирусных инфекций наружных покровов.

Теоретический материал для самоподготовки

Вопрос 2. Герпесвирусы (семейство Herpesviridae) Герпесвирусы (сем. Herpesviridae) - крупные оболочечные днк-содержащие вирусы.

Вопрос 3.

Вирусы гепатитов в, с, д Гепаднавирусы (семейство Hepadnaviridae)

Вирус гепатита c

Вирус гепатита d (hdv)

Раздел 3. Методическое обеспечение контроля знаний студентов

Раздел 4. Учебно-методическое обеспечение дисциплины

Вопрос 2. Коринебактерии дифтерии Сorynebacterium diphtheriae (род Corynebacterium)

C. diphtheriae - палочковидные бактерии; вызывают дифтерию (греч. diphtheria - кожа, пленка) - острую инфекцию, характеризующуюся фибринозным воспалением в зеве, гортани, реже в других органах, и явлениями интоксикации.

Морфологические и культуральные свойства.

Corinebacterium diphteriae – тонкие, слегка изогнутые или прямые грамположительные палочки, расположенные под углом друг к другу в виде римских пятерок. Они утолщены на концах за счет наличия зерен валютина на одном или обоих полюсах клетки. Зерна валютина состоят из полифосфатов, они воспринимают анилиновые красители более интенсивно, чем цитоплазма клетки и легко выявляются при окраске по Нейссеру в виде гранул сине-черного цвета, тогда как тела бактерий – окрашивается в желто-зеленый. При окраске по Граму зерна валютина не выявляются.

Рисунок мазка из чистой культуры. Окраска по Нейссеру Мазок из чистой культуры.

Окраска щелочной синькой Леффлера

Дифтерийная палочка не обладает кислотоустойчивостью, неподвижна, спор не образует, имеет микрокапсулу с входящим в ее состав корд-фактором. В состав клеточной стенки входят галактоза, манноза, арабиноза, а также большое количество липидов, в том числе некислотоустойчивые миколовые кислоты.

Возбудитель дифтерии – факультативный анаэроб, гетеротроф, растет при 37 о С на сложных питательных средах: свернутая кровяная сыворотка, кровяной теллуритовый агар.

На элективных средах через 8-14 часов образует точечные, выпуклые желтовато-кремовые колонии с гладкой или слегка зернистой поверхностью. Колонии не сливаются и имеют вид шагреневой кожи.

На теллуритовых средах возбудитель дифтерии через 24-48 час образует черные или черно-серые колонии в результате восстановления теллурита до металлического теллура.

Возбудитель дифтерии обладает высокой ферментативной активностью. Дифференциально-диагностическими признаками C. diphteriae являются:

отсутствие способности ферментировать сахарозу и разлагать мочевину,

способность продуцировать фермент цистиназу.

Возбудитель дифтерии не однороден по культуральным и биохимическим свойствам. В соответствии с рекомендациями Европейского регионального бюро ВОЗ вид C. diphteriae подразделяют на 4 биовара: gravis, mitis, intermedius, belfanti.

На теллуритовой среде биовар gravis образует сухие, матовые, крупные, плоские, серовато-черные колонии, приподнятые в центре. Периферия колонии светлая с радиальной исчерченностью и неровным краем. Такие колонии напоминают цветок маргаритку. Биовар mitis образует мелкие, гладкие, блестящие, черные, выпуклые колонии с ровным краем, окруженные зоной гемолиза. Биовары intermedius и belfanti фактически относятся к биовару mitis, так как не разлагают крахмал, а этот признак у C. diphteriae является наиболее стабильным.

Антигенная структура. C. diphteriae имеют О-антиген (липидные и полисахаридные фракции, расположенные в глубине клеточной стенки) и К-антиген (поверхностный термолабильный белок). О-антиген является межвидовым. На основании К-антигена различают около 58 сероваров.

Факторы патогенности. Основными факторами патогенности C. diphteriae являются поверхностные структуры, ферменты и токсины .

Поверхностные структуры (пили, компоненты микрокапсулы: корд-фактор, К-антиген, миколовые кислоты ) имеют белковую и липидную природу, способствуют адгезии микробов в месте входных ворот, препятствуют фагоцитозу бактерий, оказывают токсическое воздействие на клетки макроорганизма, разрушают митохондрии.

Ферменты патогенности: нейраминидаза, гиалуронидаза, гемолизин, дермонекротоксин . Нейраминидаза отщепляет N-ацетилнейраминовую кислоту от гликопротеидов слизи и поверхности клеток, лиаза расщепляет ее на пируват и N-ацетилманнозамин, а пируват стимулирует рост бактерий. В результате действия гиалуронидазы повышается проницаемость кровеносных сосудов и выход плазмы за их пределы, что ведет к отеку окружающих тканей. Дермонекротоксин вызывает некроз клеток в месте локализации возбудителя. Вышедший за пределы сосудов фибриноген плазмы контактирует с тромбокиназой некротизированных клеток организма и превращается в фибрин, что и является сущностью дифтерийного воспаления. Внутри дифтерийной пленки C. diphteriae находят защиту от эффекторов иммунной системы и антибиотиков, размножаясь, они образуют в большом количестве основной фактор патогенности - дифтерийный гистотоксин.

Дифтерийный гистотоксин оказывает блокирующее действие на синтез белка в органах, наиболее интенсивно снабженных кровью: сердечно-сосудистая система, миокард, нервная система, почки и надпочечники.

Эпидемиология. В естественных условиях дифтерией болеет только человек, не обладающий устойчивостью к возбудителю и антитоксическим иммунитетом. Заболевание распространено повсеместно. Наибольшее количество больных наблюдается во второй половине сентября, октябре и ноябре. Наиболее восприимчивы дети дошкольного и младшего школьного возраста. Среди взрослых к группе повышенного риска относятся работники общественного питания и торговли, школ, детских дошкольных и медицинских учреждений.

C. diphteriae обладает устойчивостью к факторам окружающей среды: в капельках слюны, прилипших к посуде или игрушкам, на ручках дверей они могут сохраняться до 15 дней, на предметах окружающей среды – 5,5 мес., могут размножаться в молоке. При кипячении C. diphteriae погибают в течение 1 мин, в 10% растворе перекиси водорода – через 3 мин, в 5% растворе карболовой кислоты и 50-60% спирте – через 1 мин.

Дифтерийный гистотоксин очень неустойчив и быстро разрушается при действии света, нагревании, окислении.

Патогенез.

Источником инфекции являются:

1.носители токсигенных штаммов - особенно опасны те носители, у которых нет клинических проявлений заболевания, так как они обладают антитоксическим иммунитетом.

2.больные: Среди больных наибольшее значение имеют лица с локализацией процесса в верхних дыхательных путях. Больной эпидемиологически опасен в течение всего периода болезни, даже в период выздоровления он выделяет токсигенные штаммы в окружающую среду.

Основным механизмом заражения является аэрозольный. Пути передачи:

ведущая роль принадлежит воздушно-капельному,

иногда могут осуществляться воздушно-пылевой, контактно-бытовой, а также алиментарный (через молоко) пути передачи.

Входными воротами инфекции служат слизистые оболочки ротоглотки (небные миндалины и окружающие их ткани), носа, гортани, трахеи, а также слизистые оболочки глаз и половых органов, поврежденные кожные покровы, раневая или ожоговая поверхность, незажившая пупочная ранка.

Наиболее часто встречается дифтерия зева ( 90-95%). Инкубационный период длится от 2 до 10 дней. По патогенезу дифтерия относится к токсинемическим инфекциям , когда микроб остается в месте входных ворот инфекции, а все клинические проявления связаны с действием экзотоксина.

Начальным этапом инфекционного процесса является адгезия микроба в месте входных ворот. Размножаясь там, микроб выделяет гистотоксин , который оказывает местное действие на клетки тканей, а также поступает в кровь, что ведет к возникновению токсинемии.

В области входных ворот развивается воспалительная реакция, которая сопровождается некрозом эпителиальных клеток и отеком, образуется налет белого цвета с сероватым или желтоватым оттенком, содержащим большое количество микробов, продуцирующих токсин.

Характерным признаком дифтерии является фибринозная пленка :

Если слизистая оболочка образована однослойным эпителием (гортань, трахея, бронхи), возникает крупозное воспаление , здесь пленка располагается поверхностно и легко отделяется от подлежащих тканей.

Если слизистая оболочка образована многослойным эпителием (ротоглотка, надгортанник, голосовые связки), возникает дифтерическое воспаление , когда все клетки прочно связаны между собой и с подлежащей соединительнотканной основой. Фибринозная пленка в этом случае плотно спаяна с подлежащими тканями и не снимается тампоном. При попытке сделать это слизистая оболочка кровоточит.

Иммунитет. После перенесенного заболевания формируется стойкий и напряженный гуморальный антитоксический иммунитет. Продолжительность поствакцинального иммунитета – 3-5 лет.

Микробиологическая диагностика.

Материалом для исследования является фибринозная пленка, слизь из зева или носа.

Сбор материала необходимо проводить в течение 3-4 ч (не позднее 12 ч) с момента обращения больного. Для взятия материала используют сухие ватные тампоны, если посев будет произведен в течение 2-3 ч, при транспортировке материала тампоны смачивают 5% раствором глицерина.

Методы диагностики :

Основным методом диагностики является бактериологический. Бактериологическая лаборатория через 48 ч должна дать ответ о наличии или отсутствии C. diphteriae в анализах.

Материал засевают на питательную среду. Отбирают подозрительные колонии и выделенную культуру идентифицируют:

По наличию цистиназы (проба Пизу): в столбик питательного агара с цистином уколом засевают исследуемую культуру. Посевы инкубируют при 37 о С 24 ч. C. diphteriae вызывает почернение среды по ходу укола в результате образования сульфида свинца.

По наличию уреазы (проба Закса): готовят спиртовый раствор мочевины и раствор индикатора – фенолового красного, которые перед употреблением смешивают в соотношении 1:9 и разливают в агглютинационные пробирки. Исследуемые бактерии вносят петлей и растирают по стенке прибирки. В положительном случае через 20-30 мин инкубации при 37 о С среда приобретает красный цвет в результате расщепления мочевины уреазой.

Способности C. diphteriae продуцировать токсин (устанавливается в реакции преципитации в агаре). Для этого в чашку Петри с питательным агаром, содержащим 15-20% лошадиной сыворотки, 0,3% мальтозы и 0,03% цистина помещают полоску фильтровальной бумаги, пропитанную антитоксической противодифтерийной сывороткой, содержащей 5000 АЕ/мл. Чашку подсушивают при 37 0 С 30 мин и бляшками засевают испытуемые штаммы на расстоянии 0,6-0,8 см от края бумаги. Посевы инкубируют при 37 0 С 24 ч. В положительном случае в месте соединения токсина с антитоксином в среде образуется преципитат в виде белых линий – «усиков».

Для определения токсигенности возбудителя дифтерии может быть использована биопроба. Морской свинке внутрикожно или подкожно вводят испытуемую культуру. Токсигенные культуры убивают животных в течение 3-5 суток, при вскрытии обнаруживаются гиперемированные надпочечники, а при внутрикожном заражении – некроз кожи.

Для бактериоскопического исследования (как самостоятельный диагностический метод применяется редко ввиду полиморфизма возбудителя, но может быть проведен по просьбе врача) из материала готовят мазки на нескольких стеклах, один мазок окрашивают по Граму, другой по Нейссеру, третий – обрабатывают флюорохромом – корифосфином для люминесцентной микроскопии.

О наличии антитоксического иммунитета судят по реакции Шика – реакции нейтрализации токсина антитоксином. В кожу предплечья вводят 1/40 DLM дифтерийного токсина. Покраснение и припухлость в месте введения свидетельствует об отсутствии антитоксинов в крови. Отрицательная реакция Шика говорит о наличии антитоксинов.

Для ускоренного обнаружения дифтерийного токсина, как в бактериальных культурах, так и в сыворотке крови, применяют: РНГА с антительным эритроцитарным диагностикумом, РИА и ИФА. Из молекулярно-генетических методов исследования применяют ПЦР.

Препараты для специфического лечения дифтерии.

В целях нейтрализации дифтерийного гистотоксина применяют специфическую противодифтерийную лошадиную очищенную концентрированную сыворотку, которую получают путем гипериммунизации лошадей дифтерийным антитоксином.

Специфическое лечение противодифтерийной сывороткой начинают немедленно при клиническом подозрении на дифтерию. Необходимо выбрать оптимальный режим введения сыворотки, так как антитоксин может нейтрализовать только не связанный с тканями токсин. Для профилактики развития анафилактического шока сыворотку вводят дробно по А.М. Безредке. Введение сыворотки позднее 3-го дня болезни нецелесообразно.

Разработан противодифтерийный иммуноглобулин человека для внутривенного введения. Его применение дает меньше побочных реакций.

Для подавления размножения C. diphteriae в месте входных ворот обязательно назначают антибиотики. Препаратами выбора являются пенициллин или эритромицин, либо другие β-лактамы и макролиды.

Препараты для специфической профилактики дифтерии.

Для создания искусственного активного антитоксического иммунитета применяют дифтерийный анатоксин. Очищенный и концентрированный препарат входит в состав ассоциированных вакцин:

1. адсорбированной коклюшно-дифтерийно-столбнячной вакцины (АКДС-вакцина),

2. адсорбированного дифтерийно-столбнячного анатоксина (АДС-анатоксин),

3. адсорбированного дифтерийно-столбнячного анатоксина с уменьшенным содержанием антигенов (АДС-М),

4. адсорбированного дифтерийного анатоксина с уменьшенным содержанием антигена (АД-М).

Базисный иммунитет создается у детей согласно календарю прививок. Только 95% охват населения прививками гарантирует эффективность вакцинации.